體外血腦屏障模型的研究進展及其在新藥研發中的作用

王伯松 郭安臣 王 群

（1 哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2 北京腦重大疾病研究院，北京 100069；3 首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京 100050；3 國家神經系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100076；5 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100076）

血腦屏障（brain-blood barrier，BBB）是腦毛細血管阻止某些物質（多半是有害的）進入腦循環血，從而保持腦組織內環境的基本穩定的一種基本結構。從生物學和功能角度來看，BBB在維持腦內穩態方面起著至關重要的作用，因為BBB功能的惡化會誘發或加重中樞神經系統疾病。相反，BBB阻礙有害物質的同時也阻礙了治療大腦內多種神經疾病的靶向藥物。本文即通過血腦屏障模型建立的研究進行綜述。

1 血腦屏障的結構

血腦屏障（BBB）是中樞神經系統正常功能所必需的擴散屏障。BBB的內皮細胞與身體其他部位的內皮細胞不同，他們的細胞質厚度均勻，沒有開窗而且具有更廣泛的緊密連接（TJs）以及少量的吞飲囊泡。內皮細胞緊密連接限制親水分子穿過BBB的細胞旁通路。相反，小的親脂性物質，如O2和CO2則可以沿著它們的濃度梯度通過自由擴散穿過質膜進入腦實質內[1-2]。葡萄糖、氨基酸等營養素通過轉基因蛋白進入大腦，而像胰島素、瘦素和鐵轉鐵蛋白等更大分子的攝取則通過受體介導的內吞作用[3-5]。除了內皮細胞以外，BBB的組成成分還包括毛細血管基底膜（BM），星形膠質細胞的末端，足細胞以及包埋在BM內的周細胞（PC）組成。基底層由血管周圍的星形膠質細胞產生，它具有包括細胞黏附和遷移的機械支持，以及跨細胞受體（整聯蛋白）建立連接細胞的細胞骨架元素到細胞外基質（ECM）橋梁的功能[6]。這層基底層還調節細胞之間的溝通，是血管系統和大腦之間的另一個大分子障礙通道[7]。周細胞是BBB結構中細胞成分最少的部分，但在血管結構完整性及分化，和內皮緊密連接的形成中起至關重要的作用[8]。由此看來，BBB的所有組成成分對于BBB正常功能和穩定性都是必不可少的。

2 血腦屏障模型的建立

2.1 利用Transwell建立體外BBB模型：這是最簡單可行也是最常見的體外BBB模型。在靜態系統培養條件下，將單層腦毛細血管內皮細胞EC接種在可滲透的支架上。在Transwell小室中，將允許溶質通過的微孔半滲透的支架置于細胞生長培養基中，再將細胞接種在支架底部，使其在滲透膜之間通過[9-10]。這種BBB模型允許內皮細胞進行遷移。已經有大量的動物以及人的腦血管EC用于建立血腦屏障體外模型。雖然這種模型比較穩定，成本也比較低，但是缺乏相鄰細胞群之間的信號傳導，如星形膠質細胞以及周細胞，和機械性刺激的致敏性調節，如剪切應力。這就很大限度的限制了長期維持BBB模型特性的能力[11]。

因此在這個模型的基礎上建立了更加復雜的共培養系統來進一步完善BBB模型。其中被使用最廣泛的就是星形膠質細胞與腦血管內皮細胞的共培養系統，因為星形膠質細胞在血腦屏障細胞群緊密發展中起至關重要的作用。最常見的方法之一，是將ECs接種在微孔濾膜的上層，而將星形膠質細胞接種在下層，雖然這樣可以使兩種細胞直接接觸，但是高于體內的厚度使細胞間的作用力受到了限制。另一種方法是將星形膠質細胞在容器底部培養，使釋放的因子通過擴散透過濾膜與內皮細胞相接觸。還有一種方法是將神經元，星形膠質細胞與周細胞三種細胞群共培養的BBB模型。將ECs接種在微孔濾膜的上層，下層接種星形膠質細胞，在容器底部接種神經元。也有研究將星形膠質細胞和周細胞混合接種在容器底部來進行試驗[12]。這種添入神經元的共培養系統所形成的BBB模型，在某種程度上可以對藥物治療中樞神經系統的影響進行評估。但由于共培養系統所形成的環境較為復雜，使得可管理性大大降低。

2.2 永生化內皮細胞系建立BBB模型：目前許多研究開發了不同來源的永生化內皮細胞系，但卻只有少數能夠表達BBB在體內的功能和特性。在最近的研究中，Rahman等[13]共統計了36種利用永生化內皮細胞所建立的BBB模型。其中人腦微血管內皮細胞系hCMEC/D3，大鼠腦血管內皮細胞系RBE4和小鼠腦微血管內皮細胞系bEnd.3是被用來建模次數最多的三種細胞系。這種細胞系建立的模型能夠有效地體現較多BBB的EC特性，使得體外的BBB模型更具有人的特性。這個細胞系能夠保持體內的內皮表型，包括許多受體以及轉運蛋白，直至幾十代[14-15]。在使用該細胞系的時候，可以通過將其與周細胞或是星形膠質細胞共培養的方式來改善BBB屏障的緊密度[16]。

大鼠腦血管內皮細胞系RBE4在BBB建模中表現出較好的特性，但其缺乏形成TJ的復合物，導致細胞旁通透性較高，限制了其在CNS藥物分布檢測中的應用。小鼠腦微血管內皮細胞系bEnd.3和bEnd.5在商業的利用比較廣泛，其中細胞系bEnd.3的模型由于TJ蛋白水解蛋白-5，閉合蛋白以及緊密連接蛋白ZO-1的高水平表達表現出比bEnd.5更加緊密的屏障[17]。bEnd.3細胞系細胞生長速度快，低細胞旁通透性以及可以保留數代的內皮表型，使其建立的BBB模型更具開發性[17]。

2.3 通過3D細胞外基質（ECM）建立BBB模型：通過使用一種細胞外基質（ECM）與同質的細胞群，如星形膠質細胞、周細胞及微血腦管所共組建的2D培養物已經被廣泛應用。但是這種2D培養物所建立的BBB模型只能將細胞培養限制在平面環境中。而最近幾年出現了三維球體、三維水凝膠以及ECM和固體支架所建立的3D培養模型[18-19]。其中Chrobak等[20]就是通過建立這種三維細胞培養的方法來產生微血管，以此來研究內皮細胞和上皮生理學。他們使膠原凝膠形成一個圓柱形通道，在其中融合了人的單層ECs，再將血管周細胞加入其中，也可以等到EC細胞生長到可融合后加入。但是這個模型缺乏剪切應力以及因為擴散等因素所造成的外部刺激。

Ⅰ型膠原通常被選作為細胞外基質來建立體外模型。膠原蛋白作為從各種生物資源中分離出來的天然水凝膠，它不但可以與整聯蛋白受體相互作用來調節基因表達外，還可以支持三維細胞的生長與分化[21]。目前已經有許多研究將其應用于細胞增殖、細胞遷移、炎癥作用以及藥物毒性和腫瘤細胞的侵襲中[22-24]。聚-D-賴氨酸或是基質膠也可以選做細胞外基質來建立模型。其中基質膠可以形成厚而松散的交聯凝膠，能夠促進3D組織的生長。相比之下，膠原蛋白和層粘連蛋白則能夠自發形成3D凝膠且具有固有的自發聚合能力。當然這種3D微環境也存在著許多缺陷。例如在培養ECs時，氧氣、營養以及可溶性的生長因子的分布在整個培養層中是不均勻的，而且凝膠會隨著介質的擴散出現梯度。而天然水凝膠的提取是從動物中分離出來，存在著組合后的變異性。合成水凝膠是由純非天然分子所組成，這些分子具有生物惰性，并能夠產生明確的3D微環境。其制作簡單，方便適應機械力，且重現性高。希望在不久的將來能夠出現具有天然水凝膠和合成水凝膠組合特性的ECM，以此來應對不同的3D微環境所導致不同的細胞反應。

2.4 微流體組織裝置建立BBB模型：微流體組織裝置是近年來受到較多關注的一個模型，有研究將其加入BBB模型的建造中，以此能夠判斷剪切應力對BBB的影響[25]。它將微工程技術與活細胞群體結合起來，較好的體現體內環境的組織特征，包括空間定義的共培養物和極化細胞的結構。在一個設計好的芯片方案中，通過使用“軟光刻技術”將彈性體材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）模塑成光定義的母模來制造微流體通道[26]。然后將多孔細胞培養基質（大多是聚酯或聚碳酸酯膜或薄的穿孔的PDMS膜）密封在通道網絡之間[27-28]。這些通道使得膜的只有一側能夠通過，并將一些細胞群引入并附著在通道中。該裝置能夠維持細胞流動并不影響細胞增殖，施加剪切應力的同時誘導結合并建立極化組織。這種組織裝置在過去的研究中已經成功地建立包括肺、腸以及脈管系統等屏障模型[29]。

邵曉劍等[30]構建了一個微流控芯片平臺以模擬血腦屏障，他將平臺分為三個模塊：血腦屏障模型，包括中間夾有半透膜且上下交叉的直通道；三維細胞培養室，用于細胞毒性實驗，微固相萃取柱芯片，用作樣品進入質譜分析前的除鹽和富集。實驗測得的三維培養的腦組織細胞模型可進一步評測藥物在腦部組織中的擴散和藥效，藥效結果也更接近體內數據。Brown等[31]將3D凝膠直接結合到微流體結構中來創建神經血管單元NVU。他將底部灌注通道從腦室與多孔膜分離，一端培養ECs，另一端培養周細胞以及星形膠質細胞。然后將腦室用人誘導的多能干細胞（hiPSC）衍生的神經元3D膠原Ⅰ凝膠填充。頂部灌注通道用來維持腦室的細胞活力。TEER測量的結果在細胞培養的12天內顯著增加，內皮TJs的ZO-1染色，以及減少的FITC-綴合葡聚糖轉運都可以證明屏障功能。

Herland等[32]采用“黏性指法”的方法在微流體的通道內建立了一個圓柱形的膠原凝膠[33]。為將聚合前膠原體的中心除去，在通道內充滿膠原蛋白和可控的流動流體。然后將人的皮質星形膠質細胞包埋在大塊的凝膠中，并依次將人的皮質周細胞和微血管內皮層細胞附襯在內腔表面，以此來創建神經血管單元NVU。這種方法成功實現了細胞生長所需的生理結構，并通過VE-鈣黏蛋白和ZO-1染色驗證了內皮單層及TJ的存在。這種方法還可以進一步用來探索NVU炎癥的特性。

2.5 基于干細胞建立BBB模型的進展：以動物為來源所建造的BBB模型已經被廣泛的應用到各項實驗研究中，但由于物種的差異使得其不能夠在臨床神經科學和藥物的開發上得以應用[34]。而分離原代人腦EC的有限性及高額的成本使得應用人的BBB體外模型的研究受到了阻礙[35]。而作為原代培養替代物的永生化人BBB內皮細胞系卻具有單層完整性及較低的TJ蛋白表達。因此，在神經血管研究的領域開發出能夠更加模擬出人體內環境的BBB模型仍是當前研究的重點。

近幾年對于干細胞的研究有了新的科學進展，這使得研究該方面的各種人類疾病和有關藥物的研究提供了新的研究途徑[36-40]。多能干細胞和成體干細胞均表現出顯著的自我更新能力，并且可以獲得任何特定的細胞表型[41-42]。而誘導多能干細胞（iPSC）或胚胎干細胞（ESC）的開發也已經被用于建造體外人BBB模型[43-44]。同樣人的臍帶造血祖細胞也被人們用來建造體外人BBB模型。Ponio等[45]曾在星形膠質細胞存在的情況下，使用臍帶血干細胞的內皮祖細胞集中定向誘導，產生了類似于hCMEC/D3細胞系的單層完整性的BBB模型性質。而與周細胞共培養的來源于造血干細胞的ECs所建立的BBB模型則顯示出具有功能性和成熟性的反應，并具有持續性的屏障緊密性[46]。與其他的體外BBB模型相比，這種模型的穩定性遠好于那些屏障緊密性差的模型。

對于原代神經元和星形膠質細胞分離的難題，使得胚胎及人腦神經元祖細胞（NPC）成為了建立體外穩定血腦屏障模型的潛在選擇[47-48]。因為人腦神經元祖細胞（NPC）能夠廣泛增殖并可以分化出神經元和星形膠質細胞譜系，而這些譜系是BBB在體內發育和成熟的關鍵[48]。基于人類PSC的BBB模型建立的研究，Stebbins等[44]對使用各種hiPSC細胞系和優化人源化BBB模型方面的開發取得了很大的進展。該過程涉及hiPSC黏附培養未成熟的NPCs和EPC的分化，然后對EC基質的規格選擇和純化。純化后的BMECs表現出細胞間輪廓的富集TJ蛋白的表達以及各種具有功能性的外排轉運蛋白的極化表達。主要在于周細胞被視黃酸處理后調節IMR90-c4衍生的BMEC單層，可與分化的人的NPC共培養使得BBB表型富集。而除了視黃酸外，用于早期維持干細胞的基質源與分化前的初始hPSC接種密度，也顯著影響BMEC的數量及BBB的緊密度。由此可見，hPSC衍生的BBB模型具有潛在的可能性作為可靠的藥物篩選工具[49]。雖然可能需要更多的化合物來對此進行測試，但不可否認的是其利用前景。而且還可以將干細胞與微流體方法相結合，來開發用于高通量研究的更穩定強大的BBB模型平臺。

2.6 以3D打印技術建立BBB模型：到目前為止，3D打印技術已經應用于復制人的皮膚、骨骼以及耳朵和肝臟等人體器官[50]，也被應用于創造灌注功能性的血管通道[51]。這種3D打印技術，包括平版印刷文件的打印是通過計算機斷層掃描或是磁共振成像捕獲的二維圖像的層析重建所創造的。由于NVU具有很大的復雜性，使其在腦血管中的應用受到了很大限制，建立BBB模型的復雜環境還有待開發。

3 新藥研發在BBB模型中的進展

新藥研發與人類健康息息相關，能夠促進人類衛生事業的發展和進步[52]。中樞靶向藥物在治療中樞神經系統疾病，如帕金森病，腦腫瘤以及阿爾茨海默病等疾病的難點就是在于血腦屏障的阻礙。而克服血腦屏障即成為了藥物研發成功的關鍵所在[53]。

針對緊密連接，有研究人員通過高滲作用使腦內毛細血管內皮細胞暫時脫水而產生收縮，導致細胞體積變小間距變寬，進而通過被動擴散將藥物帶入腦內[54]。Cote等[55]則通過合成緩激肽及類似物能夠破壞BBB通透性的特性，應用了兩種新型強效BK激動劑，單用或合用來改變BBB的通透性，來提高藥物生物利用度。Kim等[56]發現通過腺苷受體信號調節機制能夠影響細胞骨架分子，從而引起內皮細胞形狀發生改變，使得緊密連接開放，BBB的通透性提高。針對轉運蛋白的功能，P-gp作為能夠識別和外排異源物的底物，成為了藥物進入腦內一道難以逾越的障礙。使用相應的抑制劑，雖減少其抑制的功能，但臨床效果并不佳[57]。而通過溶質載體，可幫助分子穿過細胞屏障，其中Ronaldson等[58]發現通過TGF-β/ALK5信號通路上調作用，能夠使Oatpla4相應的底物增加攝取量，以此來作為潛在的靶點，對BBB內流轉運蛋白的功能性表達進行精確的控制，引導藥物轉運至腦內。針對定點釋放藥物，如今聚集超聲應用熱和力學機制，非集中性的集中到身體內部，能夠產生廣泛的生物效應，目前有些外科手術嘗試應用于腦部的非入侵性消融治療[59]。Hirschberg等[60]使用外源性或內源性光敏劑，采用成功可逆開放選定區域的BBB，實現了遞送藥物和MRI對比劑的目的。對于血腦屏障以及作用藥物的研究還在不斷的進行中，更深入了解轉運系統和細胞內的信號轉導通路，發現和發掘新型的神經系統藥物，還需我們更加深入的探索。

4 現狀與展望

血腦屏障在腦內缺乏開窗，以限制外源性物質的進入，從而起到對腦部神經中樞保護的作用。NVU細胞之間的相互作用及影響是對BBB功能的形成及維持至關重要的。隨著生物技術的不斷進步以及人們研究的不斷深入，在體外建立BBB模型方面的研究也從細胞間通過Transwell共培養所建立簡單的體外BBB模型，到通過永生化細胞系、微流體裝置以及3D細胞外基質等方法來使得BBB模型更加復雜并具有功能性，更加貼近體內環境的同時且能夠維持更久的屏障功能。使得人們在科研道路上取得新的進展的同時，也為研究腦內相關疾病及藥物研發的工作者提供了新的線索。