先天性巨結腸腸壁神經組織免疫組織化學分析與檢驗學研究

孫 瀾 鄒 偉 劉曉華

（1 遼寧省遼陽市中心醫院檢驗科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省瓦房店市中心醫院檢驗科，遼寧 瓦房店 116300）

先天性巨結腸（Hirsch sprung's disease，HD）是小兒外科的常見病，其病理特征是病變腸段黏膜下層及肌層間的神經節細胞缺如，神經纖維的廣泛增生，但在新生兒、嬰幼兒術后標本由于其神經節細胞本身發育往往不夠成熟，在病理上易于與其他組織細胞相混淆。為此我們采用一組單抗及多抗試劑，對腸壁神經組織進行免疫酶標組織化學染色，以期能夠找到一種特異性強、準確性高的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇本院2016年1月至2017年10月所保存的HD病理蠟塊資料中隨機選擇20例，分別對其近端有神經節細胞段和遠端無節細胞段進行研究。正常對照組標本取自3年病理尸檢資料中相應腸壁組織學無異常改變者12例。第一抗體神經元特異性烯醇化酶（NSE）抗體，S-100蛋白抗體均為DAKO公司產品。ABC免疫酶標試劑盒購自華美生物工程公司上海分公司。

1.2 方法：采用ABC法進行免疫過氧化物酶法染色。切取4 μm厚度石蠟切片經37 ℃烘片1 h，二甲苯脫蠟，經過梯度灑清至蒸餾水洗，為阻斷內源性過氧化物酶，用0.3%H2O2甲醇液室溫下作用20 min，再經0.05%trypsin消化后加上2%正常馬血清以降低背景的非特異性染色，傾去血清后加入第一抗體于濕盒內孵育1 h，經PBS洗3次后加入第二抗體（橋抗：biotin-抗兔或抗鼠IgG），室溫下作用30 min后滴加入ABC試劑，最后DAB顯色，甲基綠復染，中性樹膠封片。

2 結 果

2.1 NSE染色：正常對照組12例及HD病例20例神經節細胞分布正常段腸壁的黏膜下層和肌層間神經叢中均見有細胞質內NSE染色陽性的神經節細胞，其細胞核周圍的雪旺氏細胞為陰性染色，20例HD病例遠端無節細胞段腸壁內不見NSE染色陽性的細胞，僅見神經纖維周圍平滑肌細胞輕微的非特異性染色。

2.2 S-100蛋白染色：12例正常對照組及20例IID病例節細胞分布正常段腸壁神經叢中神經節細胞呈陰性染色，而周圍的雪旺氏細胞為S-100蛋白陽性染色；在20例HD病變腸壁的神經叢中只見致密深染的神經纖維而無胞質淡染的神經節細胞存在。

3 討 論

神經元特異性烯醇酶（Neuron Specific Enolase，NSE）來源于神經細胞及神經纖維，是一種糖酵介酶，用標記的抗NSE抗體于標本中的NSE結合，可清晰地顯示腸黏膜下的神經組織[l-2]，如先天性巨結腸患兒在NSE免疫組化標記以后，可表現為無神經節細胞存在，而神經纖維大量增生[3-4]。S-100蛋白存在在神經元軸突的外圍細胞—雪旺氏細胞內，同樣用免疫組化的方法，可將標本中的S-100蛋白進行標記，在切片上清晰顯示。在正常腸壁組織S-100蛋白染色可顯示圍繞神經節-圈的衛星細胞，中間神經節細胞不被染色而呈“空洞”，在先天性巨結腸“空洞”結構不存在，而顯示大量增生的神經纖維[5-6]。因此采用免疫組化的方法一一多克隆抗體與神經組織特異結合，對于常規染色難于確定的患兒，具有很大的幫助[7-8]。本組12例正常對照組兒童標本神經節細胞質對NSE呈明顯陽性反應，ABC作為顯示劑結果為紅色，并清楚地顯示神經節細胞的形態及分布，與不著色的結締組織細胞、平滑肌細胞徑渭分明。對S-100蛋白12例正常對照組標本中的雪旺氏細胞呈陽性反應，在位于神經節周圍的鞘細胞著色時，與陰性的神經節細胞形成明顯對照。本組20例先天性巨結腸兒童狹窄段標本對NSE呈陰性反應，可明顯確認沒有神經元存在，S-100蛋白也不顯示神經節細胞存在，并可顯示增生、雜亂無章的神經纖維叢，這些神經纖維延伸至固有膜[9]。

上述研究結果表明，NSE免疫組化法大大提高了病理醫師對本病黏膜下神經節細胞的鑒別能力，在很少幾張切片就能顯示結果，不需傳統大量連續切片。S-100蛋白因能顯示雪旺氏細胞，明顯襯托出陰性的神經節細胞，二者結合起來，就不會把雪旺氏細胞、神經節細胞與結締組織混淆起來，為診斷本病提供可靠的科學依據[10]。