銀杏幼胚離體誘導培養技術研究

丁鐵玉

【摘? ?要】 該試驗以銀杏幼胚作為外植體，以0.1%HgCl2溶液作為消毒劑，設置消毒時間為6min、8min、10min三個配比，采用4種不同配比的誘導培養基配方對銀杏幼胚進行誘導培養研究。通過比較不同消毒時間下銀杏幼胚的成活率、萌發率、污染率，及不同誘導培養基上銀杏幼胚萌發成苗的生長狀態，最后結果得出：幼胚使用0.1%HgCl2消毒8min最佳;MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA配方最有利于銀杏幼胚誘導。

【關鍵詞】 銀杏;幼胚;升汞;消毒時間;誘導培養

Study on in vitro induction culture of young embryos of ginkgo biloba l

Ding Tieyu

（Garden management office of? Tongyu county， Jilin province? ?137200）

[Abstract] In this experiment， young embryos of ginkgo biloba were used as explants， 0.1% HgCl2 solution was used as disinfectant， and three proportions of disinfection time were set as 6min， 8min and 10min. Four different proportions of induction medium formula were used for induction culture of young embryos of ginkgo biloba. By comparing the survival rate， germination rate and pollution rate of young embryos of ginkgo biloba under different disinfection time， as well as the growth status of young embryos germinating into seedlings on different induction medium， the final result was： young embryos were sterilized with 0.1% HgCl2 for 8min， which was the best. MS+ 1.0mg· l-1 6-ba +1.0mg· l-1 NAA formula is most favorable for induction of young embryos of ginkgo biloba.

[Keywords] ginkgo biloba; young embryo; mercuric chloride; disinfection time; induction training

銀杏，為銀杏科銀杏屬植物，拉丁學名為Ginkgo biloba.L，是我國非常著名的一種鄉土樹種，為中生代的一種孑遺植物，被稱為人類的活化石。該植物樹形端莊，姿態優美，尤其葉子獨特秀雅，到秋季之后一片金黃，非常美觀，觀賞價值極高，在園林中應用非常廣泛，可以作為行道樹、獨賞樹、林叢樹等多用綠化應用。銀杏常用的繁殖方法為播種繁殖，但由于其種子成熟特殊，為生理后熟，導致播種期延后，另外由于種皮較厚不容易發芽，播種繁殖需要提前進行長時間的層積催芽，這些均影響到了銀杏的繁殖速度。因此本實驗嘗試以其幼胚為原材料，研究其離體誘導培養技術，由于整個離體培養過程復雜，該試驗主要針對誘導階段進行具體研究，以為整個銀杏的離體培養奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本次試驗開始于2018年4月～2019年4月，銀杏種子購買于江蘇省沭陽縣新河鎮好心情園藝基地。試驗藥品有：MS大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分所需各種藥品，瓊脂，NAA、6-BA等生長激素，次氯酸鈉、升汞、75%酒精等消毒劑，98%濃硫酸、無菌水等;試驗儀器有：高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、超凈工作臺、電子天平、電磁爐、不鋼鍋、培養箱等。

1.2? 試驗方法

1.2.1外植體接種方法? 銀杏種子用清水沖洗30min，然后將種子放入燒杯中，加入98%濃硫酸，進行浸泡，時間為2h，期間每隔10min，用玻璃棒進行攪動一次，直至銀杏種子外皮基本被腐蝕。倒掉濃硫酸，用清水進行沖洗，時間為30min。在超凈臺內，在盛有種子的燒杯中加入75%酒精浸泡30s，然后用無菌水沖洗5次。用配備好的升汞消毒溶液（0.1%HgCl2）對其進行消毒，消毒時間分三個梯度，分別設為6min、8min和10min，然后用無菌水對其沖洗8次。

接種時將種子放在經過滅菌處理的鐵質托盤中，用解剖刀和鑷子剝去銀杏種子果皮，再沿著子葉中縫將其剝開，用攝子取出完整的幼胚，小心地去除附著在幼胚表面上的白膜，不要破壞幼胚，然后將其放置在經滅菌處理過的濾紙上。將處理好的幼胚接種到不同配比的培養基中，每瓶接種1粒，1個處理設為5瓶，重復3次。最后，封好封口膜，貼好標簽，將其放置于環境適宜的培養箱中培養，每隔7d觀察生長狀況，并做好記錄。

1.2.2 誘導培養基的配比? 誘導培養基設為4個配比，分別為：Y1：MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA;Y2：MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA;Y3：MS+1.5mg·L-16-BA+1.5mg·L-1NAA;Y4：MS+2.0mg·L-16-BA+2.0mg·L-1NAA。

1.2.3 培養條件? 將接種后的培養瓶放入培養箱中進行培養，培養箱濕度設置在80%。在誘導培養階段，培養箱溫度設置為（25±1）℃，光照強度設置為2000 Lx，每日光照時間設置為14 h。

2? 結果與分析

2.1? 0.1%HgCl2三個消毒時間對銀杏幼胚的影響

幼胚接種25d后，統計各瓶中幼胚污染率、萌發率和成活率，具體結果如表1。由表1可以看出，隨著消毒時間的增加，污染率逐漸降低，但萌發率和成活率也不斷降低。當消毒時間為6min時，成活率較高，為81.67%，但污染率也最高，為8.33%。當消毒時間為8min時，成活率最高，為88.33%，污染率也較低，為3.33%。當消毒時間為10min時，污染率最低，為0%，但成活率陡降，為68.33%。由此可見，幼胚的最佳消毒時間為8min。

2.2? 幼胚在不同誘導培養基上的生長情況

將處理好的幼胚接種至4種不同配方的誘導培養基中，各瓶中幼胚開始生長，在接種的第25 d后，統計各瓶中幼胚的生長情況，具體結果見表2。由表2看出，隨著植物激素6-BA和NAA含量的增加，幼胚的生根數和整體生長形態呈倒U型分布，這說明植物激素6-BA和NAA含量的增加并非一直有利于銀杏幼胚的生長。另外，幼胚莖由纖細到粗壯的變化，也說明了增加植物激素6-BA和NAA的比例會促進幼胚莖的生長。但在此過程中，莖的長度與生長形態卻也隨之變矮和彎曲，導致畸形苗的產生。相比較之下，配方Y2（MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA）更適合作為幼胚誘導培養基的配方。

3? 結論與討論

通過觀察銀杏幼胚在三種不同消毒時間梯度處理過的生長形態，從中綜合對比出，將外植體消毒的最佳時間為8min;比較4種不同配比的誘導培養基對幼胚的誘導生根狀況，得出配方MS+1.0mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA最有利于銀杏幼胚的初代誘導。此次試驗對銀杏幼胚進行誘導培養，雖然在個別幼胚根部發現有少量的愈傷組織，但大部分多是生長成為幼苗，和預想的試驗結果存在一定偏差。因此，在對銀杏進行離體繁殖時，還需對外植體的選擇、接種方法以及培養條件等做進一步的研究。希望本次試驗的結論可以為銀杏離體快繁技術提供一些依據，為今后深入研究銀杏組培試驗提供有效的試驗數據，并且最終達成加速銀杏產業規模化育苗的目標。

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