人參灰霉病研究進展△

劉琨，李勇，王蓉，丁萬隆

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.引起的灰霉病是一種重要的全球性農業病害。灰葡萄孢寄主廣泛，可侵染糧食作物、經濟作物、蔬菜、果樹、藥用植物等586屬1400余種植物[1]。灰葡萄孢潛伏期長且具有低溫致病性，對貯藏期蔬菜、瓜果等威脅較大。

灰葡萄孢變異頻率高、再侵染頻繁、抗藥性強，屬于存在高抗藥性風險的致病菌之一。灰葡萄孢以菌絲、分生孢子和菌核侵染寄主植物的莖、葉、花和果實等，并在侵染后期產生分生孢子或菌核[2]。

不同來源的灰葡萄孢無明顯的寄主專化性，如灰葡萄孢B.cinerea、草莓葡萄孢B.fragariae、卡羅萊納葡萄孢B.caroliniana、中華葡萄生葡萄孢B.sinoviticola和蘋果葡萄孢B.mali均能引起草莓灰霉病[3]。農作物上的灰葡萄孢也可侵染人參引發病害，如：除人參灰霉菌外，番茄灰葡萄孢和草莓灰葡萄孢亦可侵染人參葉片，且致病力較強[4]。鑒于以上兩點，建議在人參灰霉病綜合防治中予以高度重視。

1 葡萄孢菌的分類

葡萄孢無性態屬于半知菌亞門Deuteromycotina、絲孢綱Hyphomyeetes、絲孢目Myphomycetales、淡色孢科Moniliaceae，有性態屬于子囊菌亞門Ascomycota、盤菌綱Discomycetes、柔膜菌目Helotiales、核盤菌科Selerotiniaeeae、葡萄孢盤菌屬Botryotinia[5]。Botrytiscinerea是葡萄孢屬真菌的一個復合種，也是本屬最大的類群，常以無性態侵染植物并傳播孢子。灰葡萄孢菌孢子梗細長不分枝或分枝群生，有隔膜，長317～940 μm，直徑8.5～12.3 μm。灰葡萄孢菌菌絲透明，直徑5～6 μm，分生孢子叢生于孢梗或小梗頂端，似葡萄串狀，單個孢子倒卵形、球形或橢圓形，光滑，近無色，(8.4～15.8)μm×(6.3～12.6)μm。在PDA培養基上，菌落初呈淡白色，后轉為灰色，同時伴有菌核生成[6]。

灰葡萄孢表型變異豐富，根據其分生孢子的產生、分布以及菌核有無，Paul[7]將其分為菌絲型、孢子型和菌核型。張艷杰等[8]通過形態觀察和生長速率測定，將分離自不同葡萄種植區的143株灰葡萄孢菌劃分為菌絲型(40.56%)和菌核型(59.44%)；菌絲型又分為6個亞型(M1～M6)，以M6亞型居多；菌核型分為5個亞型(S1～S4，S6)，以S3亞型居多。研究還發現，灰葡萄孢致病力與灰葡萄孢的形態型、寄主無明顯相關性，但與菌株所在地域存在關聯，通常相似環境分離的灰霉病菌致病力也相近。結合酶切片段以及環酰菌胺敏感性測定，Albertini等[9]、Fournier等[10]將灰葡萄孢B.cinerea分為2個亞種，即group I和group II；而Walker[11]通過對法國葡萄園灰霉菌多樣性分析，將group I亞種重新命名為假灰葡萄孢B.pseudocinerea。

2 灰葡萄孢菌的致病機理

灰葡萄孢菌分生孢子首先附著于寄主表皮細胞，隨后孢子萌發形成芽管和附著胞，幫助灰葡萄孢侵入[12]。灰霉菌可分泌大量的細胞壁降解酶，從寄主組織獲取營養完成自身生活史[13]。灰葡萄孢菌侵染過程中產生纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、活性氧物質、蛋白酶、脫落酸、乙烯、毒素等致病因子，用以擾亂、破壞寄主植物防御系統，殺死寄主細胞，成功完成侵染定殖。缺失上述致病因子合成相關基因會導致灰霉菌毒性減弱甚至完全喪失[14]。

死體營養型病菌侵染的最終結果是將寄主的營養物質分解轉化為自身物質。灰葡萄孢菌寄主的共同特點是細胞壁中果膠含量高[15]。研究發現，灰葡萄孢菌至少含6種多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)基因，其在侵染時上述基因的表達情況與寄主、組織類型及環境因素等密切相關[15]。RNA-seq研究結果表明，灰葡萄孢菌能合成多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、纖維素酶、半纖維素酶等水解酶，且侵染時灰葡萄孢水解酶的表達量與寄主果膠等多糖類物質含量密切相關[16]。

3 人參灰霉病的發生與危害

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬藥用植物，為我國傳統名貴中藥材，主產于我國東北地區[17]。

人參灰霉病于1984年首次在中國渾北河口參場被發現，隨后在韓國等地也有報道[18]。人參灰霉病通常6月下旬開始發生，7月中旬至8月下旬進入發病盛期。該病主要為害人參葉片、葉柄、花和果實，造成莖、葉萎縮枯死，嚴重時亦可為害莖及根部[19]。近年，灰霉病在東北人參產區危害逐年加重，通常病株率為15%～30%，嚴重地塊超過50%，已成為影響人參產業持續健康發展的限制性因素之一[20]。

發病初期葉部出現水漬狀、灰褐色斑點，多從葉尖或葉緣開始侵染而呈倒V形，后病斑迅速擴展，葉片正反面生出灰色霉層。發病后期病斑組織壞死，易破碎脫落，葉片穿孔[19]。莖部首先出現水浸狀小點，逐漸擴展為淺褐色，長圓形或不規則形，嚴重時病部以上莖葉枯死，產生大量霉層；柱頭或花瓣被侵染后，向果實或果柄擴展，受害果實不能成熟產籽[6]。

4 人參灰霉病的發病規律

4.1 灰霉菌生物學特性

灰葡萄孢菌絲在5～30 ℃均可生長，最適產孢溫度25 ℃，孢子8～32 ℃均可萌發，孢子萌發和菌絲生長最適溫度20～24 ℃。灰霉菌孢子萌發要求較高的相對濕度(RH≥90%)，濕度過低孢子無法萌發。灰葡萄孢菌絲生長和孢子萌發喜弱酸性環境，最適pH值分別為5.0和6.2，菌絲生長對光照不敏感[21]。人參灰霉菌孢子、菌絲和菌核致死條件分別為50、55、60 ℃處理10 min。

4.2 人參灰霉病病害循環

灰霉菌以菌絲體、分生孢子、菌核在病株殘體或土壤中越冬。菌核抵抗不良環境條件的能力較強。翌年春天條件適宜時，灰霉菌菌核萌發產生新的菌絲體及分生孢子，后者經氣流、雨水、農事操作、昆蟲活動等途徑在寄主間傳播[22]。具備外滲物營養條件下，分生孢子萌發并通過傷口、自然孔口及幼嫩組織侵入寄主組織，新生成的分生孢子往復侵染，進一步導致病害發生和流行。灰霉病發生與環境溫度、濕度關系密切，空氣濕度高、澆水后逢雨天或地勢低洼積水等，均有利人參灰霉病發生[23]。

4.3 影響病菌侵染的因素

灰葡萄孢是一種弱寄生真菌，通常無法侵染健康植物組織，只能在衰老植物組織中定殖。灰葡萄孢菌分生孢子濃度對侵染效果影響較大。高濃度分生孢子接種后多形成芽管的頂點型，能快速完成侵染；低濃度分生孢子接種后多形成附著胞和侵染墊，2～4 d完成侵染，及時施藥可阻止侵染結構的形成，從而降低病害發生風險[24]。植物傷口可加快病菌侵入，即使空氣中無自由水，分生孢子也可通過傷口完成侵染。

5 人參灰霉病的防治

灰霉菌基因型豐富，表現型多樣，對環境適應性強。另外，灰霉菌繁殖快，變異頻率高，對化學殺菌劑存在不同程度抗藥性，導致人參灰霉病的防治難度較大。目前，用于人參灰霉病防治的技術手段主要有下面幾種。

5.1 化學防治

化學防治是當前灰霉病防治中最為經濟、有效，且使用最為普遍的防治方法。自20世紀70年代，相繼開發出苯丙咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯基氨基甲酸酯類、苯基吡咯類、三唑類等化學殺菌劑用于人參灰霉病的防治。目前，人參病害登記農藥有：苯醚甲環唑、丙環唑、赤霉酸、代森錳鋅、多菌靈、多抗霉素、噁霉靈、哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌、醚菌酯、嘧菌環胺、嘧菌酯、噻蟲·咯·霜靈、噻蟲嗪、霜脲·錳鋅、王銅、乙霉·多菌靈、異菌脲。2018年5月29日，在撫松召開了人參生產用藥登記專家審定會，此次會議針對13種人參生產用農藥——嘧菌酯、嘧霉胺、氟硅唑、烯酰嗎啉、多抗霉素、氟啶胺、氟嗎-唑菌脂、甲霜-霜霉威、精甲-惡霉靈、氫氧化銅、雙炔酰菌胺、氨基寡糖素等通過初步評審。灰霉病防治的殺菌劑主要包括：異菌脲、嘧霉胺、腐霉利和福美雙等。但是病菌對上述殺菌劑的抗(耐)藥性也在逐漸產生，亟需尋求新的灰霉病防治方法，以減緩病菌抗藥性的產生。

5.2 生物防治

生物防治是近年來新興的植物病害防治方法，該方法環境友好、毒副作用小、無殘留，是用于人參病害防治的理想選擇。木霉是生物防治中應用最廣的一類。其通過合成抗菌素、營養競爭、重寄生等途徑達到抑菌效果[25]。Dik等[26]研究發現，哈茨木霉T39和出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans能顯著降低灰霉病株死亡率，防效高于異菌脲。潘曉曦等[27]從人參根際土中篩選出7株枯草芽孢桿菌，其中6株對人參灰霉病有良好的抑制作用。上述菌株的挖掘為人參灰霉病生物防治奠定了良好基礎。目前，受復雜環境因素的制約，微生物菌劑在使用中可能存在防效不穩定等問題，但是經過菌株改良及菌劑制備工藝的提升，相信上述問題都能得到解決。隨著中藥材人工栽培面積的不斷擴大，藥用植物病害問題愈發突出；加之國家對中藥材病蟲害防治過程中化學農藥使用的嚴格限定和規范，生物防治將迎來巨大的發展空間。

5.3 其他途徑

我國藥用植物資源豐富，多種中草藥中的藥效物質或次生代謝產物對灰葡萄孢具有顯著的抑菌效果。研究發現，木醋液對灰霉菌菌絲體及孢子萌發有很強的抑制作用[28]。潘曉曦等[29]研究發現，丁香、五味子、北豆根、細辛、白頭翁、錦燈籠的乙醇提取物均對人參灰霉菌菌絲生長及孢子萌發有抑制作用；其中，丁香乙醇提取物的病害防效與多菌靈1000倍液相當[30]。此外，通過加強田間管理、合理灌溉、平衡施肥等手段，也可增強寄主抗病性，有效減緩人參灰霉病害的發生與危害。

6 結語

灰葡萄孢作為一個復雜的生物學群體，研究過程中應盡可能擴大取樣范圍及樣本數量，深入探究病菌的形態型及基因型差異，以及致病性與地域、寄主來源、氣候區等的關系。另外，還應結合抗藥性實驗，動態監測特定產區灰葡萄孢菌的抗藥性變化情況，提早預防，防止高抗藥性菌株引發嚴重的灰霉病流行。采用DNA重組技術、細胞質融合技術構建出耐不良環境或耐藥性強的工程菌株[31]。灰葡萄菌的致病機理研究也在逐漸深入，為開發灰葡萄孢菌特有致病途徑中的蛋白、酶抑制劑提供了理論基礎[2]。

目前，植物病害防治主要依靠化學殺菌劑。但日益嚴重的環境污染、病菌抗藥性及農藥殘留問題，迫使病害防治策略發生轉變。積極研發新型高效、低毒化學農藥，加快環境友好型微生物菌劑的研制、升級和示范推廣，是確保人參灰霉病可防可控的關鍵[32]。此外，加強人參種植過程中的田間管理，對于人參病害防治也至關重要。