基因編輯技術(shù)在家畜育種中的研究進(jìn)展

基因編輯技術(shù)可以從分子水平上對某個基因進(jìn)行定點修飾，就可用來改良動物性狀，所以其在動物育種中也起到巨大的作用。

基因編輯技術(shù)是在DNA水平上對遺傳進(jìn)行修改的。相對于RNA干擾（RNAi）、蛋白質(zhì)阻斷劑等技術(shù)而言，可以帶給生物體長久的可遺傳的變異。現(xiàn)在主導(dǎo)的基因編輯技術(shù)的核酸酶包括鋅指蛋白核酸酶（zinc-fingernucleases,ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs） 和通過 sgRNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9核酸酶。基因編輯技術(shù)的用途廣泛，包括基因功能研究、基因治療、制作抗體藥物、構(gòu)建模式動物、改造和培育新品種等。但目前基因編輯技術(shù)主要在醫(yī)學(xué)上運用，在家畜上的運用不多。應(yīng)用基因編輯技術(shù)可對家畜的生產(chǎn)性能從分子水平上加以改善，還可以培育出抗病性良好的多種家畜，在育種上發(fā)揮了極大的作用。

一、在家畜上的應(yīng)用

1.牛

Richt等（2007）敲除了牛的PRNP基因，使其腦部的PrPC蛋白表達(dá)顯著下降，對朊蛋白造成的瘋牛病起到了有效的預(yù)防。Yu等（2011）在應(yīng)用ZFN技術(shù)敲除牛乳中具有致敏性的 β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）基因，提高了牛奶的營養(yǎng)價值。Jeong等（2016）借助CRISPR/Cas9技術(shù)將人成纖維細(xì)胞生長因子2（humanfibroblastgrowthfactor2,hFGF2）基因?qū)氲脚３衫w維細(xì)胞的β-casein基因內(nèi)含子中，對牛囊胚進(jìn)行體細(xì)胞核移植，在細(xì)胞和胚胎水平上均檢測到hFGF2基因的表達(dá)，為最終得到表達(dá)人成纖維細(xì)胞生長因子2的基因編輯牛奠定了基礎(chǔ)。

有研究表明BMP15和GDF9基因在雌性動物的卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，馮萬友（2015）利用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術(shù)突變水牛BMP15和GDF9基因，提出了提高水牛繁殖性能的可行性。高旭建（2016）在牛上利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源打靶技術(shù),對乳腺特異性表達(dá)人胰島素的轉(zhuǎn)基因動物制備進(jìn)行了初步研究。在國內(nèi)對牛Myostatin基因敲除已有一些研究進(jìn)展，肌肉生長抑制素（MSTN）基因的表達(dá)可抑制肌細(xì)胞的增殖與分化，通過對MSTN基因的敲除可引起動物表現(xiàn)“雙肌”性狀，對肉牛等肉用家畜的培育起到極大幫助。Wu等（2015）開發(fā)利用TALE切口酶技術(shù)將小鼠的SP110基因敲入到牛的常染色體中，得到了23頭轉(zhuǎn)基因牛。

隨后經(jīng)過體內(nèi)和體外地轉(zhuǎn)染實驗，證明了SP110轉(zhuǎn)基因?？捎行У牡挚古＝Y(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumbovis,M.bovis）的侵襲，大大提高了牛對結(jié)核病的抗性。通過檢測其后代的抗性，證明了該基因可遺傳。Gao等（2017）又首次利用CRISPR/Cas9n技術(shù)將NRAMP1（naturalresistance-associatedmacrophage protein-1,NRAMP1）基因敲入奶牛的基因組中，獲得了抗M.bovis的11頭轉(zhuǎn)基因奶牛。經(jīng)檢測11頭奶牛均未檢測到發(fā)生脫靶效應(yīng)，證明了應(yīng)用這種新型CRISPR技術(shù)可減少消除脫靶效應(yīng)，為研究更多轉(zhuǎn)基因家畜提供了可能。

2.羊

熊鍇（2013）利用鋅指核酸酶技術(shù)敲除了奶山羊BLG 基因。Ni等（2014）選擇 MSTN（myostatin）、核孔蛋 白 155 （Nucleoporin155,NUP）、BLG 和 朊 蛋 白（prionprotein,PrP） 基因作為靶基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對山羊原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行了單個基因的單/雙等位基因敲除以及4個基因的同步敲除，對山羊多種有益于人類的多種性狀進(jìn)行改善。2015年，Cui等（2015） 利用 TALEN將人乳鐵蛋白（humanlactoferrin,hLF）替換了羊的β乳球蛋白，提高了羊奶的營養(yǎng)價值。皮文輝等（2015）通過構(gòu)建TALENs電轉(zhuǎn)染至綿羊成纖維細(xì)胞中，經(jīng)檢測完成了FGF5基因在綿羊成纖維細(xì)胞中的起始密碼子ATG定點敲除，為進(jìn)一步驗證綿羊FGF5基因與羊毛毛長的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

隨后，阿力瑪（2016）和李佳鑫（2016）等分別利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除絨山羊FGF5基因，為培育出高產(chǎn)絨的FGF5基因編輯絨山羊奠定基礎(chǔ)。李聰和曹廣文（2015）成功應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對綿羊MSTN基因進(jìn)行敲除，證明該系統(tǒng)可以對于綿羊基因編輯，研究產(chǎn)生的突變細(xì)胞系為制備MSTN基因敲除羊提供了材料。劉?。?015）利用CRISPR/Cas9技術(shù)對絨山羊的胎兒成纖維細(xì)胞和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中MSTN基因成功進(jìn)行敲除。

2016年，影響綿羊毛色ASIP基因編輯產(chǎn)生不同毛色的綿羊在新疆誕生。Fat-1基因表達(dá)為ω-3脂肪酸脫氫酶，可使脂肪酸由ω-6形式轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3，從而有益于調(diào)整動物機體內(nèi)部脂類代謝。張駒等（2016）通過CRISPR/Cas9編輯技術(shù)成功敲除了山羊的MSTN基因，并且在該位點中插入Fat-1基因的載體，用電轉(zhuǎn)染法將目的基因轉(zhuǎn)至絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，依靠體細(xì)胞核移植法來制備轉(zhuǎn)Fat-1基因絨山羊，希望選育出既增加羊肉產(chǎn)量，又能提升羊肉中ω-3含量的山羊新品種。

3.豬

在豬到人異種移植中會引起超急性移植排斥反應(yīng)。Hauschild等（2011）利用ZFN獲得了α-1，3-半乳糖基因敲除豬，為器官移植手術(shù)中產(chǎn)生的超急性免疫排斥反應(yīng)的應(yīng)對提供了思路。Yang等（2011）研究中將ZFN技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)組合，制備出過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ基因定點突變的敲除豬，有利于研究PPARγ基因在人腦血管疾病中的作用。Hauschild等（2011）又進(jìn)一步使用鋅指核酸酶技術(shù)完成了豬的GGTA1基因的雙等位基因突變，并且發(fā)現(xiàn)通過該技術(shù)可只經(jīng)一代的體外核移植得到敲除該雙等位基因的純合基因型。Carlson等（2012）在豬的細(xì)胞中實現(xiàn)了TALEN技術(shù)介導(dǎo)的多種基因敲除，表明了TALEN技術(shù)在豬上應(yīng)用趨于成熟。

Li等（2014）在豬的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個ROSA26基因位點，并用TALEN介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可進(jìn)行定點重組酶介導(dǎo)的基因敲入，有助于解決轉(zhuǎn)基因豬表型不一的問題。阮進(jìn)學(xué)（2015）研究根據(jù)基因組編輯技術(shù)針對豬H11位點創(chuàng)建了一個高效的定點整合系統(tǒng)，使更為高效安全的制備轉(zhuǎn)基因豬成為可能。Hai等（2014）對豬的vWF基因構(gòu)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)組合一步就成功進(jìn)行編輯，vWF基因突變的表型出血十分嚴(yán)重，為治療血管性血友病提供了相似的模型，證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在大動物模型構(gòu)建中的高效性。Marron等（2013）研究發(fā)現(xiàn)通過ZFN技術(shù)敲除豬的MSTN基因，破壞肌肉生長抑制素的合成，可明顯提高豬的瘦肉率。

我國也有許多研究表明應(yīng)用編輯MSTN基因可培育出含有“雙肌”性狀的優(yōu)良豬種群。郭仕妹（2016）首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)和ssODN成功模擬MSTN基因自然突變，為獲得肌肉表型更明顯的克隆豬奠定了基礎(chǔ)。另外，由于這種基因編輯豬的突變類型是在動物中自然存在的，并已經(jīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。因此，通過這種模擬自然突變建立的高生產(chǎn)性能豬更容易被人們接受?？惦y難等（2016）利用顯微注射法將sgRNA和Cas9mRNA注入豬孤雌胚胎，敲除了B2M和CIITA基因，使之主要組織相容性復(fù)合體I類與II類分子失去生物活性，進(jìn)而可抑制T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的強度，成功的實現(xiàn)利用豬單個胚胎進(jìn)行高效快速的CRISPR/Cas9打靶位點檢測。王敏等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，RGS雙熒光替代性報告載體的使用可以有效提高CRISPR/Cas9在豬胚胎成纖維細(xì)胞中對BMP15基因的打靶效率，為今后通過體細(xì)胞核移植技術(shù)培育BMP15基因編輯豬，提高母豬繁育能力提供依據(jù)。

二、存在的問題及發(fā)展前景

基因編輯技術(shù)發(fā)展至今已達(dá)到一定的高度，在建立動物疾病模型、培育新動物品種和治療遺傳疾病等方面有著巨大潛力。但在降低脫靶率、提高特異性以及效率等方面還有不足，CRISPR/Cas9技術(shù)雖然比其他技術(shù)更為經(jīng)濟(jì)快捷效率高，但在應(yīng)用于不同對象上時，還應(yīng)注意使用不同的方法，怎樣完善基因編輯技術(shù)降低其脫靶率、提高特異性、增強其普適性成為當(dāng)前應(yīng)解決的問題，是否有更為有效的基因編輯技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。

三大基因編輯技術(shù)在家畜育種中起到了重要的作用，通過基因的敲除（knockout）或敲入（knockin）改變家畜的生產(chǎn)性狀，使之向?qū)θ祟愑幸娴姆较虬l(fā)展。基因組編輯技術(shù)被認(rèn)定成一種理想的基因改造工具，因其效率高、對基因的修飾精確度高而被用于大量的研究。隨著以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)的選擇友好位點、連接多基因、表觀調(diào)控等應(yīng)用的完善，今后動物育種將有可能向規(guī)模化、多基因改良的方向發(fā)展。經(jīng)過基因編輯的畜禽可促進(jìn)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，為提高人們營養(yǎng)水平和生活質(zhì)量服務(wù)。由此可知，基因編輯技術(shù)已成為現(xiàn)代生物研究的重要手段之一，為了更好地為科學(xué)研究提供良好的平臺，完善發(fā)展基因編輯技術(shù)成為了重中之重。