雞法氏囊和腺病毒精制卵黃抗體制備與應用

吳衛東 魏中鋒 徐梅 蔡文利

（1，山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 274000；2，山東省菏澤市動物疫病預防控制中心 2740001）

雞法氏囊病（IBD）是一種急性、高度傳染性可引起免疫抑制性的雞的烈性傳染病[1]。近幾年，雞法氏囊和腺病毒對目前雞養殖業已造成重大危害，尤其在有些地區還存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情況。本試驗用從當地分離的雞法氏囊和腺病毒流行株病毒制備成二聯油佐劑滅活疫苗后，經過對150日齡的蛋雞進行3 次免疫后，制備出抗雞法氏囊和腺病毒二聯精制卵黃抗體，有望對當地雞法氏囊和腺病毒疫情進行有效控制。

1 材料

1.1 毒株及疫苗

毒株為由本實驗室分離鑒定的當地流行株，疫苗為本實驗室制備的雞法氏囊和腺病毒二聯滅活油乳劑疫苗。

1.2 試驗雞

卵黃抗體雞有本地某種蛋雞養殖場提供150日齡產蛋雞50只，SPF 雞購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 試驗主要儀器

電子天平購自日本島津 (Shimadzu) 公司、高速冷凍離心機購自德國SIGMA/西格瑪公司。

1.4 試驗試劑

法氏囊瓊擴標準抗原、法氏囊瓊擴標準陽性血清，雞腺病毒I 亞群IV 型瓊擴標準抗原與標準陽性血清，購江蘇農科院家禽研究所。聚乙二醇6000 購自江蘇省海安石油化工廠。

2 方法

2.1 產蛋雞免疫

對試驗產蛋雞每只雞頸部皮下注射雞法氏囊和腺病毒二聯滅活疫苗0.5ml/只，2 周后加強免疫胸部肌肉注射滅活疫苗0.5ml/只，在第4 周后進行最后一次加強免疫頸部皮下和腿部肌肉各注射滅活疫苗0.5ml/只。

2.2 免疫雞抗體效價監測

在產蛋雞免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4 個月、6 個月時分別對所有免疫雞翅靜脈采血1.0ml，分離血清。采用瓊脂擴散方法分別測定雞法氏囊和腺病毒抗體效價。

2.3 卵黃抗體的提取

參考Ismeal Marcet 等[2]中的方法進行卵黃抗體提取，在產蛋雞注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4個月、6 個月時采集免疫蛋雞雞蛋，用清水將雞蛋外部清洗干凈，對雞蛋殼表面用75%酒精消毒處理，敲開蛋殼，用卵黃分離器分離蛋黃，挑破卵黃膜，無菌收取卵黃液，充分混勻。將收取的卵黃液和 pH7.6，0.1M 的 Tris．HCI 緩沖液按 1:2 充分混勻，加入 PEG6000 粉攪拌，使 PEG6000 最終濃度為 3.5% (W/V)，勻速攪拌使 PEG6000 完全融化，室溫孵化 30min。用高速冷凍離心機 4℃、8000prm 離心 20min，然后用 0.45gm 微孔濾膜過濾，向上清液中加PEG6000 至終濃度為12%獲取沉淀，用定量PBS 溶液溶解沉淀即為精制卵黃抗體溶液。

2.4 卵黃抗體監測

在試驗蛋雞注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4 個月、6 個月后分別提取卵黃中的抗體，采用瓊脂擴散試驗方法分別測定雞法氏囊和腺病毒卵黃抗體效價。

2.5 卵黃抗體質量檢測

按照獸藥典中的規定方法進行無菌檢驗、安全性檢驗、抗體效價檢測等常規檢驗。

2.6 臨床應用試驗

購買 90 只 21日齡的 SPF 雞，每組 30 只，分為對照組、免疫組、治療組，對照組每只雞皮下注射滅菌生理鹽水0.5ml，注射后3d，所有雞點眼接種法氏囊強毒和肌肉注射腺病毒強毒，接種量為 0.1ml/只，免疫組每只雞肌肉注射卵黃抗體0.5ml，3d 后，再接種法氏囊和腺病毒強毒，治療組接種法氏囊和腺病毒病毒液0.1ml/只，待雞出現臨床癥狀后立即腿部肌肉注射卵黃抗體0.5ml/只，3 組雞隔離飼養，專人飼喂，每日記錄每只雞的臨床癥表現和發病死亡情況，對死亡的雞解剖檢驗，記錄病理變化。

3 結果

3.1 產蛋雞免疫抗體結果

在疫苗免疫后，免疫組蛋雞血清抗體效價逐漸提高，在首免2 周后即法氏囊和腺病毒抗體效價分別為3.8log2 和4.2log2，至首次免疫后2 個月后抗體效價達到峰值8.1log2 和8.6log2，隨后開始維持在一定水平，至免疫后6 個月，法氏囊和腺病毒的抗體效價仍維持在7.3log2 和7.5log2 以上。

3.2 卵黃抗體監測結果

在疫苗免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4個月、6 個月監測提取的卵黃抗體中的法氏囊和腺病毒抗體效價，在首免3 周后，免疫組蛋雞卵黃中法氏囊和腺病毒的抗體效價逐漸提高，至首次免疫后3 個月抗體效價達到峰值8.6log2和8.7log2，隨后開始維持在一定水平，至免疫后6 個月，法氏囊和腺病毒抗體效價仍維持在7.4log2 和7.6log2 以上。經檢測，免疫蛋雞的血清抗體上升規律與卵黃抗體基本一致，但卵黃抗體的增長趨勢較血清抗體推遲5～7d，開始時卵黃抗體效價低于血清抗體效價，這可能是血清中抗體來源于血清，而逐步轉移至卵黃需要一段時間。

3.3 免卵黃抗體的質量檢驗

3.3.1 無菌檢驗結果

取高免卵黃抗體0.2ml，分別接種于鮮血瓊脂平板、馬丁肉湯和厭氣肉肝湯培養基，37℃培養72h，均未發現有細菌生長。

3.3.2 卵黃抗體安全性試驗

將制備好的卵黃抗體注射21日齡健康SPF 雞10 只，每只雞頸部皮下注射卵黃抗體3ml，觀察14d，未發現接種雞死亡和接種部位有不良反應發生。

3.4 臨床試驗結果

對照組雞在用法氏囊和腺病毒液攻毒后出現發熱、精神萎靡、拉黃綠糞便等臨床癥狀，7d 后所有對照組雞全部死亡，解剖可見心包大量積液、肝臟腫大淤血、腺胃乳頭腫大出血、法氏囊出血、腿部胸部肌肉出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理變化。

免疫組在注射卵黃抗體3日后攻毒，在14d 內只有1 只雞死亡，其余雞未表現出食欲減退、精神萎靡等臨床表現，將免疫組雞宰殺、解剖后，內臟器官未見任何病理變化，表明接種卵黃抗體0.5ml 的免疫組在免疫3d 后能完全抵抗法氏囊和腺病毒強毒株的攻擊，卵黃抗體預防法氏囊和腺病毒的效果較好，預防保護率達96.7%。

治療組在攻毒后4d 后出現臨床癥狀時及時注射卵黃抗體進行治療，在3d 后絕大多數雞精神恢復正常，在14d 內只有兩只雞死亡，其余未死亡。本試驗表明，制備的卵黃抗體對法氏囊和腺病毒強毒株感染具有顯著的治療效果，治愈率達93.3%。

4 討論與小結

本試驗利用本地分離鑒定的法氏囊和腺病毒流行株制備疫苗，在通過多次免疫產蛋雞，利用PEG6000 提取和微孔濾膜過濾獲得精制卵黃抗體，試驗結果顯示，制備的雞法氏囊和腺病毒二聯卵黃抗體對強毒感染的預防保護率為96.7%，治愈率為93.3%。對本地區法氏囊和腺病毒疫病的流行控制有極其重要的意義，尤其對一些肉雞養殖場經常發生法氏囊和腺病毒混合感染可起到有效控制[2]。