實時熒光PCR技術在動物疫病診斷中的運用

韓笑

（山東省臨沂市河東區畜牧獸醫局太平畜牧獸醫站 276029）

1 實時熒光PCR技術在動物疫病診斷的應用優勢

首先，實時熒光PCR 技術可在同一個反應中同時加入多對引物，顯著提高客PCR 配對的效率，不同的熒光分子對引物進行標記，探針或者是熒光染料等發出的信號，會被自動化儀器接受，這樣一來即使是在一次反應中也能同時對多個靶基因進行實時定量檢測，撇開檢測效率不談，單就定量檢測就能快速進行病原體混合感染的篩選，因此，被廣泛應用在臨床病原體篩選中。其次，實時熒光PCR 技術中多了熒光探針或是熒光染料，可以在PCR 反應過程中直接檢測熒光信號的變化，實現靶基因定量檢測以外，可提高擴增特異性，縮短檢測時間，因為是自動化儀器收集熒光信號[1]，能提高實驗的靈敏度，不僅實現了定性到定量的飛躍，還實現了檢測質量和檢測時間的全面提升。最后，由于實時熒光PCR 技術日漸成熟，應用中退出了熒光PCR 試劑盒，這種試劑盒的推廣改變了以往的實驗，因為熒光PCR 技術是全封閉無反應，不需要進行后續的PCR 處理，顯著避免實驗污染，提高實驗結果的分析價值，這一優勢也極大加快了熒光PCR技術在動物疫病診斷的應用。

2 實時熒光PCR技術在動物疫病診斷實際應用

2.1 診斷病毒病

熒光PCR技術在動物疫病診斷實際應用中，診斷病毒病是最常規的應用，以往PCR 技術也用于診斷病毒病。其中最為常見的就是禽流感，禽流感已成為每年都會出現一次的疾病，現如今禽流感已有16 種血凝素HA 亞型，禽流感病毒是世界性分布病毒，多數感染都是隱性感染[2]，臨床癥狀多于感冒相似，在感染初期沒有特異性的表現，只有極少數禽流感病毒具有快速傳播和高致病性的特性，國內外監測流感性病毒的方法一般是利用雞胚病毒分離方法，但這種檢測方法耗時太長，不符合臨床研究及實驗要求，也不利于禽類進出口檢疫的診斷。利用實時熒光PCR 技術檢測診斷病毒病，將檢測時間從以往的21d縮減到4h，依據張鶴曉的A 型流感病毒實驗，建立“一步法”檢測流程后，直接對A 型流感病毒的核算保守區共有序列篩選敏感性及特異性的引物，直接檢測所有A 型流感病毒的通用型熒光PT—PCR。利用這種方法能在保持敏感性的前提下縮減檢測時間，直接對泄殖腔、喉拭子和禽肉進行檢測。由此可見，實時熒光PCR 技術可顯著縮減病毒病的檢測時間，并且保證實驗結果及實驗敏感性。

2.2 新城疫

新城疫的檢測屬于副黏病毒，以往檢測也是利用雞胚病毒分離方法，但這種方法可以檢測其病株的致病性，難以明顯反應其毒株的致病力，檢測時間也需要21d。建立熒光PT—PCR方法進行形成以病毒的檢測，可以顯著分離中強毒和弱毒區，還可以避免與常見禽類病毒進行交叉反應，將免感性提高到10-7，顯著提高新城疫的檢測結果準確性。所以，熒光PCR 技術在新城疫檢查中具有較強的優勢。

2.3 反芻動物疫病

反芻動物疫病與一般的動物疫病診斷不同，近年來，我國牛羊養殖業快速發展，國際之間的牛羊進出口量增多，疫病監測等存在較大缺陷，導致牛疫病新舊疾病困擾著養殖業發展，由于不少牛病會影響人體健康，加強反芻動物疫病檢測也是目前熒光PCR 技術的主要應用領域。實時熒光PCR 技術通過雙探針能實現一步多重熒光RT-PCR 檢測，同時對多種牛病毒和邊界病毒進行檢測，且檢測敏感度能達到4.8 個TCLD50，這種方法也可以用于羊邊界病毒的檢測。WernikeK 就是利用Bo-HV-1 糖蛋白gD 和gE 基因的引物作為檢測標準，建立三重熒光PCR 方法檢測與鑒別BoHV-1 疫苗株和野毒株，這種檢測方法的敏感度高達10 個反應。多重檢測方法可以達到單重檢測的效果，顯著加快檢測效果及檢測范圍。

3 結語

綜上所述，實時熒光PCR技術在動物疫病診斷中具有顯著優勢，可以用于多種動物疫病的檢測，在提高檢測靈敏度的同時縮減檢測時間，顯著滿足疫病快速檢測的要求，便于臨床針對檢測結果制作疫苗。