實時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中的運用

韓笑

（山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧獸醫(yī)局太平畜牧獸醫(yī)站 276029）

1 實時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷的應(yīng)用優(yōu)勢

首先，實時熒光PCR 技術(shù)可在同一個反應(yīng)中同時加入多對引物，顯著提高客PCR 配對的效率，不同的熒光分子對引物進行標記，探針或者是熒光染料等發(fā)出的信號，會被自動化儀器接受，這樣一來即使是在一次反應(yīng)中也能同時對多個靶基因進行實時定量檢測，撇開檢測效率不談，單就定量檢測就能快速進行病原體混合感染的篩選，因此，被廣泛應(yīng)用在臨床病原體篩選中。其次，實時熒光PCR 技術(shù)中多了熒光探針或是熒光染料，可以在PCR 反應(yīng)過程中直接檢測熒光信號的變化，實現(xiàn)靶基因定量檢測以外，可提高擴增特異性，縮短檢測時間，因為是自動化儀器收集熒光信號[1]，能提高實驗的靈敏度，不僅實現(xiàn)了定性到定量的飛躍，還實現(xiàn)了檢測質(zhì)量和檢測時間的全面提升。最后，由于實時熒光PCR 技術(shù)日漸成熟，應(yīng)用中退出了熒光PCR 試劑盒，這種試劑盒的推廣改變了以往的實驗，因為熒光PCR 技術(shù)是全封閉無反應(yīng)，不需要進行后續(xù)的PCR 處理，顯著避免實驗污染，提高實驗結(jié)果的分析價值，這一優(yōu)勢也極大加快了熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷的應(yīng)用。

2 實時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷實際應(yīng)用

2.1 診斷病毒病

熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷實際應(yīng)用中，診斷病毒病是最常規(guī)的應(yīng)用，以往PCR 技術(shù)也用于診斷病毒病。其中最為常見的就是禽流感，禽流感已成為每年都會出現(xiàn)一次的疾病，現(xiàn)如今禽流感已有16 種血凝素HA 亞型，禽流感病毒是世界性分布病毒，多數(shù)感染都是隱性感染[2]，臨床癥狀多于感冒相似，在感染初期沒有特異性的表現(xiàn)，只有極少數(shù)禽流感病毒具有快速傳播和高致病性的特性，國內(nèi)外監(jiān)測流感性病毒的方法一般是利用雞胚病毒分離方法，但這種檢測方法耗時太長，不符合臨床研究及實驗要求，也不利于禽類進出口檢疫的診斷。利用實時熒光PCR 技術(shù)檢測診斷病毒病，將檢測時間從以往的21d縮減到4h，依據(jù)張鶴曉的A 型流感病毒實驗，建立“一步法”檢測流程后，直接對A 型流感病毒的核算保守區(qū)共有序列篩選敏感性及特異性的引物，直接檢測所有A 型流感病毒的通用型熒光PT—PCR。利用這種方法能在保持敏感性的前提下縮減檢測時間，直接對泄殖腔、喉拭子和禽肉進行檢測。由此可見，實時熒光PCR 技術(shù)可顯著縮減病毒病的檢測時間，并且保證實驗結(jié)果及實驗敏感性。

2.2 新城疫

新城疫的檢測屬于副黏病毒，以往檢測也是利用雞胚病毒分離方法，但這種方法可以檢測其病株的致病性，難以明顯反應(yīng)其毒株的致病力，檢測時間也需要21d。建立熒光PT—PCR方法進行形成以病毒的檢測，可以顯著分離中強毒和弱毒區(qū)，還可以避免與常見禽類病毒進行交叉反應(yīng)，將免感性提高到10-7，顯著提高新城疫的檢測結(jié)果準確性。所以，熒光PCR 技術(shù)在新城疫檢查中具有較強的優(yōu)勢。

2.3 反芻動物疫病

反芻動物疫病與一般的動物疫病診斷不同，近年來，我國牛羊養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，國際之間的牛羊進出口量增多，疫病監(jiān)測等存在較大缺陷，導(dǎo)致牛疫病新舊疾病困擾著養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，由于不少牛病會影響人體健康，加強反芻動物疫病檢測也是目前熒光PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域。實時熒光PCR 技術(shù)通過雙探針能實現(xiàn)一步多重熒光RT-PCR 檢測，同時對多種牛病毒和邊界病毒進行檢測，且檢測敏感度能達到4.8 個TCLD50，這種方法也可以用于羊邊界病毒的檢測。WernikeK 就是利用Bo-HV-1 糖蛋白gD 和gE 基因的引物作為檢測標準，建立三重熒光PCR 方法檢測與鑒別BoHV-1 疫苗株和野毒株，這種檢測方法的敏感度高達10 個反應(yīng)。多重檢測方法可以達到單重檢測的效果，顯著加快檢測效果及檢測范圍。

3 結(jié)語

綜上所述，實時熒光PCR技術(shù)在動物疫病診斷中具有顯著優(yōu)勢，可以用于多種動物疫病的檢測，在提高檢測靈敏度的同時縮減檢測時間，顯著滿足疫病快速檢測的要求，便于臨床針對檢測結(jié)果制作疫苗。