高效液相色譜測定乳制品中黃曲霉毒素M1

□ 朱丹倩 陶志成 孔玉婷 姚菲菲 浙江贊宇科技股份有限公司 浙江金正檢測有限公司

AFM1是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素 B1（Af latoxin B1，AFB1）污染的飼料后通過在體內經羥基化作用轉化成的代謝產物。AFM1對光、熱和酸都非常穩定，主要存在于動物的可食部分，如牛奶、肝、蛋類等，其中以牛奶最為常見，是目前發現的毒性、致癌性極強的天然有毒物，它能夠對人及動物的肝臟組織產生破壞，嚴重時會導致肝癌甚至死亡。由于牛乳及其乳制品是人類（尤其是嬰幼兒）的主要食品，乳制品營養豐富，能夠增強人體免疫力，受到很多國家的重視。因此建立簡便快捷高效的檢測方法十分重要。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260超高效液相色譜儀（配熒光檢測器）（美國Agilent公司）；3-18KS高速冷凍離心機（德國Sartorius公司）；純水凈化儀（杭州永潔達凈化科技有限公司）；ME3basic振蕩器（IKA公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（美國大地公司）；吡啶鎓三溴化物（上海安譜實驗科技股份有限公司）；免疫親和柱（北京安易世紀貿易有限公司）；黃曲霉毒素M1標準品（o2si smart solutions公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

黃曲霉毒素M1標準溶液移取至10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度。此溶液密封后避光4 ℃下保存。按需要用初始比例的流動相稀釋成適當濃度的混合標準工作液，現配現用[1]。

1.2.2 色譜條件

賽默飛 C18（4.6 μm×250 mm）色譜柱；柱溫35 ℃；流速1 mL/min（衍生劑：0.3 mL/min），進樣量50 μL；流動相為甲醇∶水=54∶46（V∶V）。熒光檢測器，激發波長360 nm，發射波長440 nm。

1.2.3 提取方法

稱取5 g混合均勻的試樣于50 mL離心管中（乳粉、特殊膳食等加入熱水,渦旋混勻）。加入10 mL甲醇，渦旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下離心10 min，將適量上清液或濾液轉移至燒杯中，加40 mL水備用。將上述樣液移過免疫親和柱。收集全部洗脫液。在50 ℃下氮氣緩緩地將洗脫液吹至1 mL以下，用水定容至1.0 mL，渦旋30 s混勻，0.22 μm 濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

選取賽默飛C18色譜柱（4.6μm×250 mm），對乙腈、甲醇、水等流動及衍生劑相進行組合，考察其保留時間、靈敏度及峰形，選取最優的流動相體系。本試驗使用甲醇代替乙腈可有效降低檢測成本。本試驗將方法優化為流動相：甲醇∶水=54∶46（V∶V），流速為1 mL/min，吡啶鎓三溴化物為衍生劑0.3 mL/min，明顯提高了靈敏度，且方便與黃曲霉毒素B族一同檢測[2]。

2.2 提取條件選擇

本試驗采用AFM1免疫親和柱作為樣品前處理方法，該方法能夠從復雜基質中富集極低濃度的目標化合物，并具有極高的選擇性。洗脫時使用2 mL甲醇可以充分將待測物洗脫，氮吹至1 mL以下直接加水稀釋至1 mL減輕溶劑效應，避免損失，操作簡便，提高了檢測效率。

2.3 方法線性關系、精密度和檢出限

黃曲霉毒素M1在0.1～20 ng/mL范圍內線性良好，相關系數大于0.999，不同陰性樣品基質中在3個濃度水平加標試驗回收率在83.6% ～94.2，相對標準偏差（RSD）為3.68%，方法檢測限（LOD，S/N≥3）為0.02 μg/kg。本方法簡便快速，重現性好，靈敏度高，結果可靠。

3 討論

本文建立了高效液相色譜測定乳制品中黃曲霉毒素M1的方法。試樣中的黃曲霉毒素M1用甲醇-水溶液提取，上清液稀釋后，經免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮后經液相色譜分離檢測。與目前的國家標準和文獻報道的方法相比，本方法在保證準確性好的同時，盡可能地提高了靈敏度，為測定食品中黃曲霉毒素M1的研究提供了數據和基礎。