基于微流體技術分選循環腫瘤細胞的方法研究

王正源，徐秀林，王燕

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093

前言

癌癥作為重大疾病之一，正嚴重威脅人類的生命健康，因癌癥而導致死亡的人數在2030年預計將達到1 300萬［1］。據世界衛生組織（WHO）統計，90%的癌癥患者死亡與癌癥的轉移相關，如果患者在癌癥轉移發生之前得到診斷和治療，至少有30%的死亡是可以預防的［2］。研究癌癥的發生發展規律，探索腫瘤早期診斷治療的新途徑已經成為當代社會急需解決的重大問題。在腫瘤組織中脫落，侵襲并進入血液循環的細胞通常稱為循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）。近年醫學上研究表明，富集及檢測在血液中出現的CTCs，不僅有助于腫瘤早期篩查、診斷、療效評價及復發轉移監控，還可以為腫瘤治療提供新的策略。

早在1869年，Ashworth首次在癌癥死亡患者的血液中發現CTCs，但有關外周血中CTCs的研究近些年才受到廣泛關注［3］。由于在外周血中CTCs含量極少，使得傳統細胞分析檢測技術無法有效識別［4］。在過去的10年中，使用CTCs作為實時液體活檢已經受到了廣泛關注，對這些細胞的進一步分析將會提高對轉移性級聯、腫瘤演變、異質性和治療耐藥性的認識［5］，強大的細胞分離技術可以快速有效地分離出CTCs并用于下游單細胞基因組和轉錄組分析。對血液樣品進行前處理，通過細胞篩選富集手段初步提高腫瘤細胞的濃度，是增強循環腫瘤細胞檢測精度和靈敏度的必要環節。

近年來，圍繞CTCs的分選富集與檢測研究中，國內外取得了顯著成果。美國強生公司的產品CellSearch System于2004年被美國食品和藥物管理局（FDA）批準商業化，該產品采用免疫納米磁顆粒富集上皮來源的腫瘤細胞，能實現對腫瘤細胞的有效富集檢測［6］。磁泳分離技術的核心優勢是其操作可連續和工作效率高。流式細胞儀和熒光掃描顯微鏡也可應用于CTCs分離，這些技術操作簡單且需要的工具容易獲得，但有資料表明他們會丟失稀少的CTCs使得檢出率低并影響細胞活性［7］。隨著微流體技術的進步，促使各種高精度、小型化的裝置快速發展，大大提高了CTCs分離過程的效率和回收率。這些小型化系統具有更高的靈敏度、精度，更低的成本以及與下游檢測或總體分析系統的兼容性好等優勢［8］。Fluxion Biosciences新開發的微流體平臺IsoFlux使用微流體通道確保將磁性顆粒標記的CTCs充分可靠地暴露于密集且強度均勻的磁場中，以實現高效的細胞富集回收［9］；有報道幾何增強型免疫捕獲芯片，采用幾何增強微結構，通過增加靶細胞與抗體包被底物之間的碰撞頻率來提高CTCs捕獲效率［10］。根據目前對CTCs的檢測分選廣泛使用的分離富集方法的原理，其可分為無標記分選和有標記分選兩類。

1 無標記分選

無標記分選是一種基于細胞的生物物理特性，如尺寸、密度、變形能力或介電性能等信息，在不需要特異性標記的情況下對細胞進行檢測和分類的微流控CTCs分選技術［11］。該類方法因操作簡單、成本低及白細胞高消耗的特點，廣泛應用于CTCs的分選富集研究。目前用做循環腫瘤細胞無標記分選的常用方法主要有以下幾種。

1.1 基于CTCs的大小與變形性差異分選

該分選方法通常情況下也稱為微結構過濾技術，利用在大小及變形性等性質上CTCs與其它血細胞存在差異進行分離。主要結構大致有圍堰式、交錯流動式、薄膜式及微柱式等類型。通常CTCs和白細胞的粒徑分別為15～25 μm和8～20 μm，兩者粒徑不同，通過在芯片微流道中設計微孔、微柱及濾膜結構，當含有CTCs的細胞溶液流過芯片微流道時，大顆粒的CTCs粘附在結構中，血細胞隨著緩沖液流出，由于在粒徑上CTCs和白細胞粒徑有交叉部分，因此一些白細胞在結構中也可能被捕獲，但增加緩沖液的流速，依據CTCs與白細胞變形能力的不同可實現二者分離。

Hosokawa等［12］設計由100×100個8～9 μm直徑的圓孔陣列組成的微流控芯片捕獲CTCs。在血液樣本中摻入NCI-H358細胞進行實驗，采用蠕動泵負壓進樣，最終腫瘤細胞固定在圓孔上，血細胞則隨緩沖液流出，從而成功分離CTCs。結果表明，混在1 mL血液中的10個CTCs可被該系統在15 min內完全捕獲，且能很好保持細胞活性。經染色鑒定其分選效率達97%，遠高于采用CellSearch系統的分選效率。ClearCell?CX System是Abnova公司基于此原理研發的分離CTCs的產品［13］。通過在芯片內部設計“爪形”結構的圓柱形微柱陣列捕獲CTCs，其捕獲過程能動態監測，捕獲的CTCs可以進行染色鑒別和計數。Lü等［14］設計了一種包含過濾和捕獲功能的間距漸變式芯片捕獲CTCs。為減少芯片堵塞，先經過濾結構濾掉樣本中的雜質；循CTCs不能通過間距不同的捕獲結構而被捕獲，在磷酸鹽緩沖液（PBS）中摻入CTCs進行實驗，其捕獲效率高于90%。Jin等［15］設計一種不同間距的“棘齒”型微柱陣列芯片捕獲CTCs，在健康人血液樣本中混入膀胱癌細胞進行實驗，其分離效率高于70%。

基于CTCs與其它血細胞在大小和變形性上的差異分選CTCs操作簡單、捕獲效率高、無表面標志物依賴，因此其應用研究較為廣泛成熟。但在應用中也存在一些局限，如該類結構普遍會出現細胞堆積導致微流道堵塞問題；尤其是圍堰式結構加工精度要求高、通量低、分選純度低，腫瘤細胞極易發生堆積和堵塞；薄膜結構的芯片要嵌入薄膜，導致鍵合要求高，工藝復雜；另外，在較大的機械力作用下，CTCs容易破裂，對分離精度和細胞活性造成一定影響。

1.2 基于細胞力學性質差異分選

1.2.1 基于慣性原理分選 在慣性效應下，直圓柱Poiseuille流動中，顆粒（如血液中的CTCs、白細胞等）遷移主要受垂直于流動方向的兩個慣性升力影響，顆粒的平衡位置也由這兩個力決定。分別是指向微通道壁的拋物線速度梯度引起剪切誘導的升力（FS）和作用于顆粒的導致顆粒向微通道中心遷移的壁升力（FW）［16］。在這兩個力的共同作用下，遷移的顆粒最終在距離壁約0.2D處平衡，其中D為圓柱形管的直徑［17］。彎曲微通道結構中，迪安流動在微通道內形成兩個反向旋轉的漩渦。最終粒子所受到的慣性升力（FL=FS+FW）和迪恩曳力（FD）共同作用，決定了粒子在流體中流動過程中的平衡位置。彎流道中不同粒徑的細胞由入口處的隨機分散狀態會逐漸發生慣性聚集，遷移至各自特定的平衡位置，再結合芯片內部結構設計，便實現對CTCs的捕獲。中國科學院蘇州生物醫學工程研究所Chen［18］依據慣性分選原理，設計了一種混合芯片。該芯片是一個三重并行的螺旋慣性微流控芯片，與若干個可數的傾斜狹縫（螺旋裂縫芯片）相互連接，用于連續分選循環腫瘤細胞。其中，傾斜的狹縫與流體方向約成60°夾角。在慣性升力和迪恩曳力相互作用下，不同尺寸的顆粒（CTCs、白細胞及紅細胞等）在螺旋微通道的不同流線處實現各自的平衡。沿流動方向設計的傾斜狹縫將分離的流線型顆粒分離到平行的較小的微通道中，連續作用導致原始微通道中某些尺寸的顆粒數量顯著減少，可以實現不同尺寸顆粒的慣性分離。同時通過設計試驗結合光學吸收檢測，證明了這種三重平行化螺旋慣性微流體的整體布置反映了第一主微通道中穩定的流線分布。另外，基于慣性原理分選CTCs技術，Kim等［19］設計了一種級聯的螺旋流道用于CTCs分選，Sun等［20］設計了一種雙螺旋結構用于CTCs分選，實驗數據表明，其分選效率和重新捕獲率均較高。

1.2.2 基于確定性側向位移分選 該分選技術是通過在微流控芯片流道內設置若干排與液體流動方向成一定角度的交錯排列的微柱陣列，當有細胞溶液在芯片流道內流動時，不同粒徑大小細胞的運動軌跡也不相同。尺寸大的細胞（如CTCs）因側向位移向一側匯聚，尺寸小的細胞（如紅細胞、白細胞等）會沿原軌跡運動，從而實現連續分離，收集到相應的細胞。Loutherback等［21］首次證明使用此方法能分離CTCs。當細胞混合液流經芯片微流通道后，大粒徑的CTCs會向芯片壁面發生側向移動而富集，而小粒徑的其它血細胞繼續保持原來的流動方向流動，在側壁通過收集即實現了CTCs分離。通過在PBS緩沖液中放入MCF-7實驗，其分離效率高于85%。Liu等［22］通過設計實驗比較對病人外周血中多種稀有癌細胞采用圓柱與三角形陣列的分選效果，指出流速在小于50 μL/min下兩者捕獲率均較高，隨流速增大，圓柱陣列的重新捕獲率顯著降低，而三角陣列仍能保持較高的捕獲率。同時研究人員還探究細胞尺寸與流速對分選效果的影響，得出細胞尺寸越大、流速越低，則分選效果越明顯［16］。

綜上所述，基于細胞力學性質差異的分離方法同樣是一種依據細胞粒徑、形態差異的被動式分選技術。具有在尺寸上對細胞的敏感度高、分選高通量的優勢。但是，基于確定性側向位移的細胞分選技術也難以避免堵塞問題，且分選效率易受細胞族的尺寸不一、細胞變形性、微柱尺寸及制造加工的表面質量等因素影響。

1.3 基于細胞電學性能差異分選

介電泳技術分選細胞的原理是基于腫瘤細胞與正常細胞在電學性質方面的差異，因介電力大小和方向不同，細胞在不同介電力作用方向上移動，從而在電場中實現腫瘤細胞的分選。Holmes等［23］通過將一種帶狀電極鍵合安置在微流控芯片上，利用兩組電極分別產生正負介電泳力，在電極的不同區段收集不同細胞，成功分離白血病細胞THP-1。Wu等［24］采用該方法設計了一種類似結構，帶狀電極的放置方向與流道的主流方向垂直，采用人結腸癌細胞HT-29設計實驗進行驗證，成功實現了將其從人體血液中分離。Alshareef等［25］也設計了一種嵌入有電極的用于CTCs分選的微流控芯片，依據不同細胞的交流頻率存在差異的原理分離細胞混合液中的MCF-7細胞，其分選效率高于93%。介電泳分選技術雖然操作較簡單，但要求細胞溶液通過非均勻電場的時間較長，所以會極大限制微流控芯片流道中微流體流速，大大降低細胞分選效率，難以在臨床上廣泛應用。由于電場的作用，其對細胞活性、電生理學特性及物理特性也有一定影響。

2 標記分選

在微流體技術中，除了可依據細胞在尺寸、可變形性等物理特性的差異實現分選，還可以通過生物標記，依據細胞在生物學上的特性差異來實現分離。同時隨著納米技術的快速發展，納米結構，如納米珠，已廣泛應用于CTCs分離富集及檢測［26］。因此，通過結合細胞與納米結構表面的粘附因子以及基于常規抗體的親和相互作用，實現對CTCs的分選富集。目前標記分選常用方法主要有：基于抗原抗體親和性分選、基于納米顆粒的免疫磁珠分選等。

2.1 基于抗原抗體親和性分選

基于抗原抗體親和性反應進行細胞分選是通過在芯片內部通道或微結構上固定標記特定分子，該特定分子一般為與細胞表面抗原對應的特異性抗體或適配體，兩者之間通過抗原抗體親和性反應而特異性結合，在細胞混合溶液通過芯片內部微通道時，目標細胞表面抗原與通道或微結構上的特定分子發生結合，細胞被固定在芯片內，從而將其捕獲富集［27］。再用合適的方法，如通入熒光染料溶液染色標記再清洗，實現對CTCs的鑒定；更換緩沖液，沖洗并回收目標細胞，實現與其它細胞的分離進行下游分析。He等［28］設計了一種在玻璃基底上修飾有EpCAM抗體的芯片用于CTCs分離，在健康人血液中摻入人結腸癌組織源細胞HCT116進行實驗，實驗中CTCs發生特異性結合而留在芯片內，資料表明其效率約為80%。Sheng等［29］通過幾何增強混合型芯片捕獲CTCs，為增大細胞與抗體的接觸機會以提高捕獲效率，芯片內部設計有V形結構。該芯片對混合在細胞混合液中的人胰腺癌細胞的捕獲效率可達90%，CTCs經洗脫后可繼續培養，用于后續的單細胞測序相關的實驗分析。使用親和性細胞富集技術的主要難點是CTCs生物標志物表達的異質性，包括在上皮-間充質轉變（EMT）過程中常見捕獲靶標EpCAM的表面表達較低。來自相同腫瘤類型的癌細胞系（如MCF-7和MDA-MB-231）也可能具有不同的EpCAM結合的表面密度。一些白細胞可能與CTCs具有相似的性質，它們常常能在富集的樣品中持久存在，從而影響分離CTCs的純度。為解決這個問題，研究人員采用消耗血細胞的陰性分選技術分離富集CTCs。盡管如此，任何富集CTCs或消耗其它血細胞的生物化學手段都可能由于不均勻的生物標記物表達而失去CTCs，或由于靈敏度和特異性受損而導致假陽性細胞的無效去除；同時抗體結合也可能誘導細胞毒性，這將不利于CTCs的下游測序。鑒于癌癥的異質性和單細胞分析的重要性，且由于與抗體包被的磁珠非特異性結合導致CTCs丟失而可能導致CTCs分離的不完全，從而制約人們對CTCs的生物學信息全面掌握。另外，親和性分選法要在通量和效率綜合考慮，流速越大，CTCs與抗體反應的時間越少，雖能提高分選速度，但會導致分選效率降低。

2.2 基于納米顆粒的免疫磁珠分選

免疫磁珠分選是采用免疫磁珠與微流控芯片相結合分選富集CTCs的技術。大量研究表明利用免疫磁珠分選技術在微流控芯片上分離CTCs操作簡便、捕獲效率高，并結合PCR技術、細胞培養技術等步驟，能夠實現檢測集成化和自動化。Kang等［30］基于納米顆粒的免疫磁珠技術設計了一種分離CTCs的芯片，在主流道兩邊設計了很多與主流道相通的且預置有磁鐵的小室，當細胞混合液在芯片流道中流動時，CTCs因標記有磁珠而被捕獲，白細胞則沿管道出口流出。將2～80個不同數目的乳腺癌細胞混入1 mL小鼠血液中進行實驗，實驗顯示其捕獲效率高于90%。Hyun等［31］設計了一種融合免疫磁珠技術和親和性分選方法中的陽性分選、陰性分選的微流控芯片用于富集CTCs。通過將表面修飾有CD45抗體的磁珠與細胞混合液中的白細胞結合，最后在一級分選流道區域利用外置磁鐵磁珠的吸附作用實現對白細胞的去除；在二級分選流道區域內表面上修飾EpCAM抗體以實現對MCF-7（EpCAM+）的富集。基于納米磁珠的免疫分選技術依賴磁性進行分選，對細胞的捕獲和釋放易于控制，且無需對管道進行修飾，靈敏度高，在研究中廣泛應用。但使用該方法同基于抗原抗體親和性分選技術一樣，受到CTCs表面標志物的限制，且磁珠與樣本的孵育預處理也是實驗的重要環節。

3 多級分選

近些年來基于微流體技術分選腫瘤細胞取得了顯著進展，但每種單一的分選方法都具有靈敏度低或分選效率不高或通量較小的限制。為能實現高通量、高純度的分選外周血中含量極低的CTCs，研究者們集成多種分選技術，設計出對CTCs多級分選的微流控芯片。Hou等［32］通過將兩個用于CTCs分選用的螺旋微流控芯片進行串聯，以實現二次提純，提高分選效率。通過實驗證實其對MCF-7能很好的實現聚集，且在3 mL/h流量下其捕獲率高于85%。東南大學倪中華教授課題組基于集成慣性分選技術和介電泳細胞分選技術提出一種多級分選芯片，一級通道通過內側低、外側高的梯形截面螺旋結構初級慣性高通量分選血液樣本溶液，二級通道通過在高寬高比的矩形截面流道底部安裝兩組電極依靠介電泳技術實現次級分選CTCs。該芯片整合了兩種技術的高通量和高分選效率的優勢，為分選CTCs的微流控芯片發展提供了一種新思路［22］。多級分選微流控芯片因其能夠很好地提高分選效果，整合各種分選技術的優勢，保證高通量分選的同時，保證對高純度的要求，使得其在臨床上具有更為實際的應用價值。其次級分選流道可以是對廢液的再次富集，提高重新捕獲率，或是再次通過陰性分選技術除雜，提高實驗后樣品的純度。

4 總結與展望

微流控芯片具有體積小、對操作人員要求低、易于滿足檢測設備對集成化、微型化發展的要求，同時大大降低了實驗對試劑的消耗，近些年來在分選CTCs的研究中應用越來越廣泛。本文詳細闡述了各種無標記及有標記技術的方法原理，并結合成功案例分析了各種方法的優缺點。微流控芯片分選細胞的技術目前仍面臨一些挑戰：處理大量血液樣本耗時久；基于細胞尺寸和變形性的分選技術易遇到堵塞；基于慣性聚焦的分選技術產生的剪切力較大會影響到細胞活性；部分CTCs會丟失表達；驗證實驗所配置的含有CTCs的溶液并不能完全真實反映臨床上病人外周血液中的情況。

盡管目前在微流控芯片推廣至臨床應用的過程中面臨著制備工藝繁雜、可靠性較差等因素的阻礙，但不可否認其在CTCs分選、富集及檢測上具有巨大潛力。多級分選芯片集成多種分選技術手段，兼具無標記分選技術通量較高和標記分選技術操控精確的優勢，更易滿足CTCs分選的要求，其目前尚處于實驗研究階段，但其良好的分選效果將成為未來微流控芯片發展的一個主要方向。同時，微流控芯片將向著更加集成化（集成細胞預處理、分選富集、計數診斷及檢測分析等功能單元于一體）、微型化、檢測功能多樣的方向發展，高效率、高精準度以及低成本的檢測必將是未來微流控芯片在CTCs檢測領域的研究重點，為實現腫瘤相關疾病的早期診斷、預后評估及藥物治療效果判定提供可靠的臨床數據。