羊肚菌藥理活性對緩解運動應急性疲勞的應用

劉 菁，宮美鳳，張立臣，黎宇翔

（北京航空航天大學 體育部，北京 100191）

羊肚菌是當前被認為是具備美味且珍稀性的食用菌。通過近年來有關研究學者的發現，羊肚菌能夠提升人體的免疫力，抗衰老，抗疲勞等，具有重要保健功效。隨著當前社會經濟水平的提升以及人們生活質量要求提升，同時，生活節奏的加快，使得人們出現了疲勞過度或者體力透支，身體抵抗力降低的問題。進一步導致在實際工作過程中工作效率降低，身體受到嚴重的健康威脅。因此，人們越來越重視抗疲勞和保健品的發展。它分為單個組分，如細胞外多糖、細胞內活性物質，細胞內多糖等、并可在緊急攝入小鼠中的不同成分后確定。身體在運動過程中產生抗疲勞，并延長運動增強運動能力的相關效果。通過研究發現，與對照組相比，細胞內多糖羊肚菌細胞外多糖具有顯著的抗疲勞作用。該結果能夠為之后醫學行業研發羊肚菌多糖抗疲勞保健品，提供重要參考。

近年來，許多研究學者都重視了羊肚菌的重要價值。其中，孫曉明在負重游泳實驗中觀察了小鼠的負重游泳時間、血清尿素氮、血乳酸等生理指標。結果發現，相比于羊肚菌子實體粉能夠延長其運動時間，減少血乳酸的水平和血清尿素氮水平，它可以增加肝糖原的量，并表現出更好的抗疲勞作用。段玉鶴等結果發現，羊肚菌的胞內外多糖能夠從一定程度上延長小鼠的運動時間，具有計量依賴性。通過大量的藥理研究證明，羊肚菌具有良好的抗疲勞效果，可以通過現代工藝技術將其制為保健品，延緩人們的抗疲勞對改善生活質量具有重要意義。在本文中我們基于段巍鶴等人的研究成果，對羊肚菌藥理活性對緩解運動應急性疲勞的應用進行深入分析。

1 實驗材料與方法

首先，段義和等人選擇的菌株。使用的試劑是小鼠抗Motus單抗，其經過初步腹水處理，HRP標記的山羊抗小鼠抗體和HRP標記的山羊抗兔抗體，其購自北京生物技術有限公司，由美國sigma公司購買一些所需的試劑，包括PDA液體培養基，其具體成分為200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 g磷酸二氫鉀、0.5 g硫酸鎂、3 g蛋白胨，加水至1mL體積并消毒20 min。所有其他試劑均購自國家公司的分析試劑。在研究中所使用的儀器有恒溫振蕩培養箱，超凈工作臺，離心機，酶標儀，紫外分光光度計，超聲破碎儀，電泳槽。

研究方法上，首先需要活化群種，并對菌種進行鑒定和擴大培養。在菌株的活化中，將菌株的試管傾斜在無菌操作臺中培養到無菌培養皿中。將培養基在PDA固體培養基中培養，并在23℃下培養1周，以獲得羊肚菌的菌絲體培養物。其次，進行菌絲鑒定，并通過加入一定量的無菌生理鹽水和海砂將取適量培養物得到的菌絲培養半小時。然后，將研磨液倒入離心管中，以300 r·min-1的轉速離心5 min，取上清液進行抗原檢測。研磨后得到的抗原分別用緩沖液稀釋，梯度控制在5倍和10倍。在12孔酶標儀上其中1到4孔可以利用5倍稀釋抗原，第5孔為 PBS緩沖液對照，6至10個孔是10倍抗原稀釋液，11個孔是羊肚菌陽性抗原對照，12個孔是空白對照。依次向各個酶標孔中加入100 μL的50倍稀釋的單抗體，常溫孵育1h之后分別用 PBS洗滌三次，甩干之后向各個孔加入100 μL經過2 000倍稀釋的 HRP羊抗鼠抗體，常溫孵育1h之后再用 PBS洗滌3次，干燥后，向每個孔中加入100 μL底物，避免在黑暗中15 min。通過酶標儀檢測每個孔中的OD值以實現擴增的培養。經過上一步的研究，檢測，便能夠鑒定羊肚菌的菌絲。可在無菌工作站上將其轉移至含有無菌PDA培養液的100 μL三角燒瓶中。用密封膜密封，置于21℃恒溫振蕩培養箱中，并以115 r·min-1溫育5 d。并做好標記，收集菌絲培養物的培養液進行下一步實驗操作。提取羊肚菌和細胞內活性物質的細胞內和胞外多糖。首先，當提取羊肚菌的胞外多糖時，我們選擇300 mL過濾并離心，并將無菌菌培養液置于50℃恒溫攪拌下。將體積濃縮為150 mL，采取sevage的方法去除菌絲中的蛋白，將去蛋白后的培養液加入三倍體積中的乙醇溶液中，置于零下20℃進行蛋白沉淀，24 h會析出絮狀白色物。經過離心，其條件為400 r·min-1，離心20 min獲得白色沉淀，加入50 mL溶菌水，進行溶解，并在50℃的水浴鍋中除去乙醇獲得胞外多糖。在提取胞內多糖時，經過液體培養的菌絲利用蒸餾水洗滌兩次，并獲得菌絲沉淀物，對沉淀按照比例50∶1加入去離子水，置于85℃恒溫水浴中2 h，離心后除去羊肚菌絲。離心之后將上清液置于50℃的恒溫水鍋中，使體積濃縮為一半。離心去沉淀，上清沉淀處理方法與胞外多糖的處理方法一致，能夠獲得胞內多糖，并進行下一步實驗操作。在提取細胞內活性物質時，采用液體培養得到的羊肚菌菌絲，用蒸餾水洗滌2次，用超聲波破碎菌絲體。將其功率設置為180 W，破碎條件為每破碎10 s，間隔15 min，循環破碎30次，利用冰塊快速降溫的方法或者停機操作，避免破碎液溫度較高。同時，在菌絲完全破碎后，也可以通過光學顯微鏡檢查，并將上清液離心。上清液是羊肚菌細胞內相中的活性物質，并在下一步中研究。

測定葡萄糖濃度曲線以及多糖濃度。在該研究中，苯酚硫酸法可用于測定溶液中多糖的濃度。每個需要100 mL每毫升葡萄糖標準溶液和6%苯酚溶液100 mL。繪制葡萄糖標準曲線，分別取0、0.2 mL、0.4 mL。將0.6 mL、0.8 mL和1 mL置于相應的管中，并加入蒸餾水至體積為2 mL。加入1 mL 6%苯酚溶液并充分混合后，加入2 mL濃硫酸，再在沸水浴中加熱反應15 min。將其放于冰塊中快速冷卻，以空白設計作為對照。使用1 cm比色皿在490 nm的波長下測量吸光度。繪制標準曲線時，以葡萄糖質量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得到標準曲線回歸方程。根據線性范圍，我們對樣品濃度進行調整，進而檢測樣品的吸光值。由線性方程獲得所測樣品中的多糖濃度，為了能夠進一步明確羊肚菌中包內胞外多糖以及胞內活性物質，有效緩解疲勞作用濃度。我們選擇8只ICR成年小鼠稱重，然后將它們分成實驗組和對照組，并在實驗組中包括3組。胞內多糖，胞外多糖，胞內活性物質這三個組，每組共計2只小鼠。將上述組份提取液分別配制為多糖濃度為14.4 mg·mL-1的溶液，以蒸餾水作為對照組。給小鼠腹部空腹后，每只小鼠需要注入1 mL的液體。測量小鼠游泳時間，比較不同組分和對照組中不同濃度多糖對游泳時間的影響。并根據結果進行下一步多糖濃度的檢測。

測定羊肚菌中胞內多糖，胞外多糖，胞內物質在抗疲勞上的作用。選擇20只經過1 d斷食之后的成年ICR小鼠對其進行稱重，將其平均分為4組，每組共計5只小鼠，可以將其分為對照組，胞外多糖，胞內活性物質組。根據上述實驗所確定具有顯著提高運動時間的胞內外多糖組，胞內活性物質組所灌注的多糖濃度，空腹灌胃之后，每只小鼠需要灌注1 mL，測定每只小鼠游泳時間，最后將所得數據利用統計學軟件進行單因素分析。

2 研究結果

首先，需要對菌株的ELISA進行間接鑒定。通過試驗我們可以知道經過活化培養之后的羊肚菌絲經過破碎處理后，做ELISA時，通過5倍和10倍稀釋，P/N值均大于2.1為陽性。在實驗結果中陽性，陰性對照組成立，進一步說明經過活化培養之后，我們所獲得的菌絲確定是羊肚菌菌絲。用水提法所獲得的多糖濃度測定結果如上表所示。初步選擇羊肚菌胞內外多糖以及胞內活性物質，抗疲勞作用的最佳濃度。我們可以通過實驗發現，在對小鼠灌胃液多糖濃度為14 mg·mL-1時，相比于多糖濃度為4 mg·mL-1，小鼠游泳時間明顯增加。與在對羊肚菌保內外多糖以及胞內活性物質抗疲勞作用進行分析時，我們可以通過數據可知，胞外多糖組相比對照組來說具有明顯的統計學意義，說明胞外多糖組與對照組的小鼠進行運動時間比較具有顯著差異，而胞內多糖組與對照組相比也具有統計學意義，但胞內活性物質與對照組相比，小鼠游泳時間無統計學意義。

3 羊肚菌藥理活性緩解運動的應急性疲勞分析

根據很多研究學者的發現，我們分析羊肚菌的發酵液中多糖與體內多糖溶液，在應急攝入之后，小鼠的游泳時間相比對照組來說具有明顯的統計學意義，說明這種多糖溶液能夠提升應激性抗疲勞作用。當羊肚菌的胞內多糖和胞外多糖濃度控制為14 mg·mL-1時，此時可以從一定程度上延長小鼠的游泳時間。在相同狀態下，高濃度的羊肚菌多糖，相比低濃度的羊肚菌多糖來說能夠明顯延長小鼠的游泳運動時間。但相比來說，胞內物質與對照組的小鼠進行游泳時間比較不具有統計學意義。這一結果也說明了影響小鼠應激性抗疲勞的主要是羊肚菌的胞內外多糖，而胞內活性物質中含有與胞內多糖抗疲勞性相互拮抗的有效成分。然而針對該機理還需要后續進行深入探索，通過上述的研究也進一步驗證了羊肚菌中的多糖能夠明顯提升應急性抗疲勞，具有一定的保健功能。我們所采用小鼠游泳實驗是在相關研究基礎上，根據實驗目的進行一次性應急灌喂，而這種方法能夠獲得直觀數據，并且在對抗疲勞保健品使用上具有一定的指導意義。該研究所采用的方法能夠為之后研究應急性抗疲勞作用，保健品研發提供參考依據。根據之前的文獻，在上述研究中采用了免疫學檢測對不同菌絲進行菌落鑒定，進而能夠提高結果的可靠性，同時所獲得的應急性灌胃小鼠游泳時間相比羊肚菌多糖抗疲勞程度來說，這一結果更具有可靠性。然而，我們分析該結構可能與所研究使用的菌種長期傳代培養，菌絲活性，多糖組分含量有一定的相關性。

4 結語

總而言之，羊肚菌是一種珍貴的藥用真菌，具有良好的經濟和藥用價值，在食品，保健，醫療方面具有廣闊的市場應用前景。研究學者發現羊肚菌中含有多種化學成分，包括多糖，酶，有機酸，氨基醇等。隨著研究技術的發展，研究人員應當致力于羊肚菌物質和分離純化活性單體，創新藥理實驗，進一步說明羊肚菌具有良好的免疫調節和抗疲勞性能。在后續研究中，應當針對羊肚菌的藥理活性機制展開深入的探索，能夠為新型藥物研發提供方向。除此之外，由于當前還無法實現規模化的人工栽培，因此還需要進一步加快規模化人工培養羊肚菌的力度。