金沙江木生淡水絲孢菌資源調查

李文麗，沈洪葦，章艷玫，阮清雄，周期山，蘇鴻雁*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理大學農學與生物科學學院，云南大理 671003）

木生淡水絲孢菌（lignicolous freshwater hyphomycetes）是一類生態復合群，主要寄生在纖維素含量較高的木質基質上，其生活史的完成需要依賴淡水環境〔1〕。木生淡水絲孢菌是水環境中重要的微生物組分，發揮著重要的生態功能〔2〕。在生態系統的物質循環中，木生淡水絲孢菌能將有機物分解成可被原生動物吸收利用的營養物質和碳源，促進水體碳循環〔3〕。其次，淡水真菌能合成多種新型化合物，有報道證明一些具有活性的次生代謝產物，對腫瘤、細菌、真菌、線蟲等有顯著的殺傷作用，因此淡水真菌在農業和醫藥開發、環境治理等領域具有潛在的研究及應用價值〔4〕。也有部分淡水真菌是淡水動植物的病原菌，能引起淡水動植物的真菌病〔4-7〕。

研究表明海拔對水生絲孢菌〔8〕、菌根菌〔9〕、溪流里的木生真菌〔10〕、土壤真菌〔11〕等微生物的群落結構和物種多樣性有影響。Geml等〔11〕研究了阿根廷安第斯山脈土壤真菌沿海拔梯度的變化并認為真菌群落的物種組成和海拔高度密切相關。Baerlocher等〔12〕對澳大利亞沉水葉片中的水生絲孢菌進行研究時發現真菌群落相似性和海拔梯度相關。Gómez-Hernández等〔13〕對沿海拔分布的外生菌根菌群落結構進行了研究，結果表明物種豐富度最高的是在中高海拔段。Shearer等〔14〕對秘魯安第斯山水生子囊菌沿海拔梯度（218～3 870 m）分布的研究中，發現在低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）、高海拔（1 000 m以上）形成3個類群，中海拔水生子囊菌的多樣性最高，低海拔次之，高海拔最低。Bahram等〔15〕對伊朗北部森林中外生菌根菌研究表明，物種多樣性隨海拔高度增加而降低，認為這可能是由于隨著海拔升高植被多樣性降低的緣故。Rahbek〔16〕研究也表明水生真菌的豐富度最高是在中高海拔段。Shearer等〔14〕認為由于研究區域的局限，不同海拔物種多樣性不同與海拔、植被（宿主）是否相關還不是很清楚，物種多樣性在中高海拔段最高還不能下結論。

金沙江地處滇西北三江并流區，流域面積廣，海拔高差顯著，支流眾多，氣候濕熱，降水充沛，植被覆蓋率高。金沙江良好的氣候條件及多樣的植被類型造就了該區豐富的物種多樣性。淡水真菌作為水體微生態系統的重要組成部分，目前尚未有金沙江淡水真菌方面的相關研究。本項目采集金沙江不同海拔、不同河段的腐木進行木生淡水真菌多樣性研究，了解該地區淡水真菌資源、多樣性特征及群落組成，為金沙江木生淡水真菌的保護與利用提供本底資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集將金沙江（石鼓鎮-白馬雪山段，海拔：1 814～3 034 m）分為10個采樣點，采集腐爛程度高（指掐木質松軟為宜），直徑1～2 cm，長10～15 cm的沉水腐木。每個采樣點采集20根樣品，共采集200根腐木，用自封袋裝好后帶回實驗室，并記錄采樣地的地理信息、溫度以及水體pH。見表1。

表1 樣點地理信息

1.2 樣品培養根據采樣點的先后順序對樣品進行編號，準備20 cm×15 cm大小的不完全封閉塑料盒，用75%的酒精噴灑消毒，在盒底墊吸水紙，用無菌水浸濕，并放置2～3根塑料吸管，將樣品放在吸管上，避免腐木與濕紙發生黏連，蓋上蓋子，在盒蓋上標明采集地點、日期、采集人等相關信息。室溫培養1～2周后開始檢測樣品，檢測期間根據樣品干濕度，可適量加無菌水，保持樣本濕潤。

1.3 形態觀察保濕培養1周后，在GL-99BI連續變倍體視鏡下觀察菌落在自然基質上的著生方式及外部形態，并用大頭針在目標菌株附近做好標記。用接種針將腐木上的菌株挑出，做成水封片后在OLYMPUS BX51生物顯微鏡下觀察并拍取能反映菌體形態、孢子梗形態、產孢結構、分生孢子等形態的照片并作相應記錄。

1.4 培養基的配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯100 g（去皮），葡萄糖粉10 g，瓊脂條8.5g，去離子水加至500mL。

水-瓊脂培養基（WA）：瓊脂條8.5 g，去離子水加至500 mL。

麥芽浸粉瓊脂培養基（MEA）：麥芽浸粉7.5 g，瓊脂條8.5 g，去離子水500 mL。

MEA斜面的配制：稱取麥芽浸粉7.5 g，瓊脂粉8.0g，加去離子水500mL煮沸，每支保種管浸注1.5mL，121℃高壓滅菌20 min取出，平置于超凈工作臺上，冷卻后即可制成斜面。

以上培養基均經高壓滅菌鍋121℃高溫高壓20 min，冷卻至50℃后加入氨芐青霉素（終濃度為100 ug∕mL）混勻，倒入平板凝固后方可使用。

1.5 菌種的分離純化觀察到目標菌株后，用無菌牙簽蘸取少量培養基，輕輕將分生孢子分離下來，采用劃線法，以便孢子分散在PDA培養基表面，并在培養皿上標明菌株編號及接種日期。室溫培養12～24 h，將萌發的孢子轉接到新的PDA或MEA培養基上，用封口膜封口并定期檢查菌落的生長情況。

1.6 菌種鑒定基于形態學及分子生物學方法對獲得的菌株分類鑒定，參考Seifert等〔17〕、Ellis〔18〕、任守才〔19〕、張凱〔20〕、張儀東〔21〕、姜于蘭〔22〕、馬建〔23〕、黃悅華〔24〕有關絲孢菌分類文獻，結合外形以及微觀形態（包括分生孢子梗，產孢結構，產孢方式，孢子的形狀、大小、顏色、分隔、真或假隔膜，有無膠質鞘或附屬絲等特征）對菌株進行初步分類。同時，刮取已獲得純培養的菌株菌絲，提取基因組DNA，測序后，將序列提交到NCBI網站上進行比對，進一步確定物種的分類地位。

1.7 菌種保存從培養基中刮取少量新鮮菌絲轉接到MEA斜面上，室溫培養至菌絲覆蓋整個斜面后，放入4℃冰箱保存，所有操作均在無菌環境中進行。該方法在保存過程中易出現培養基水分喪失、菌體失活，因此每隔半年須重新轉接，只適合短期保存。

1.8 干保本制作在體視鏡下找到目標菌，將生長有子實體的木塊用小刀切割下來，切割面積約為3 cm×3 cm。將切割下來的小木塊放在信封紙上晾干，晾干后裝入信封中，并在封口上注明編號及保存日期，在陰涼干燥處進行長期保存。

1.9 數據分析淡水絲孢菌出現頻率（%）=（某個種出現次數∕樣品總數）×100%。

采用香農-維納指數（Shannon-Wiener index）分析金沙江淡水絲孢菌的多樣性〔25〕。香農-維納指數為：

其中，H′是群落多樣性指數，Ni是第i種真菌的數量，N是所有真菌的數量，Pi是第i種真菌的數量占所有真菌數量的比例，S為所有真菌的種數。

2 實驗結果

檢測得到55株木生淡水絲孢菌，基于形態學及分子生物學方法對木生淡水絲孢菌進行鑒定，共鑒定出木生淡水絲孢菌23屬37種，出現頻率相對較高的屬為Minimelanolocus（4.5%），其次為Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%）。見表2。采用H′計算得出金沙江木生淡水絲孢菌多樣性指數是3.48，同時計算得出金沙江海拔1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上的木生淡水絲孢菌多樣性指數依次為2.07、2.01、1.57、1.50。見表3。

表2 金沙江淡水絲孢菌屬級出現頻率

續表2

表3 各海拔段淡水絲孢菌多樣性分布

3 討論

滇西北地區是世界上寶貴的物種基因庫，此區氣候濕熱，降水充沛，植被類型多樣，具有良好的物候條件。金沙江地處滇西北三江并流地區，流域內良好的氣候條件及多樣的植被類型孕育了該區豐富的物種資源。此次通過對金沙江（石鼓鎮-白馬雪山段，海拔：1 814～3 034 m）的200份腐木樣本進行檢測，共發現23屬37種，其中出現頻率最高的物種為Minimelanolocus（4.5%），其次為Stachybotrys（2.5%）和Bactrodesmium（2.5%），多樣性指數為3.48，表明金沙江淡水絲孢菌資源豐富且多樣性高，這與Shearer等〔26〕預測我國蘊含著豐富的淡水絲孢菌資源的結論一致。Shearer等〔14〕研究了低海拔（300 m以下）、中海拔（300～1 000 m）以及高海拔（1 000 m以上）的淡水真菌多樣性，得出中海拔段的淡水真菌多樣性最高，低海拔段次之，高海拔段最低的結論。本次研究對比1 800～1 900 m、1 900～2 000 m、2 000～3 000 m以及3 000 m以上各個高海拔段木生淡水絲孢菌豐度，發現隨著海拔梯度的升高，木生淡水絲孢菌的多樣性逐漸降低。由于樣品采集地的水溫及水pH并沒有隨海拔的升高而出現規律性變化，因此在本研究中溫度和pH沒有成為影響木生淡水絲孢菌多樣性分布格局的主要因素。高海拔段木生淡水絲孢菌多樣性逐漸降低的原因可能是：①隨著海拔的升高，植被的覆蓋率降低，落入水中的基質減少，淡水絲孢菌缺乏合適的著生基質；②高海拔地區的樹種為抵制嚴寒，表皮往往會形成一層蠟質，不利于淡水絲孢菌的附著。