白及組織培養初步研究

楊 琳，李玉容，張 武，朱 丹

（大理大學農學與生物科學學院，云南大理 671003）

白及Bletilla striata（Thunb.）Rchb.f.為蘭科白及屬多年生草本植物，白及干燥塊莖別名良姜、紫蘭。白及在我國主要分布于江西、江蘇、甘肅、陜西、四川、云南等地〔1-2〕，其中在云南的分布比較廣泛，主要集中分布在文山、曲靖、昆明、玉溪、紅河等地區。白及塊莖為我國傳統中藥，可用于治療咳血、潰瘍疼痛、燙傷灼傷、手足皸裂、肺結核、百日咳、食管炎、鼻竇炎、血管瘤等疾病〔3〕。白及還被譽為“美容仙子”，具有美白祛斑、除皺等美容功效，可作為粘稠劑、保濕劑和助乳化劑等用在化妝品中〔4〕。

白及種子在自然野生環境中很難萌發〔5〕，目前主要依靠鱗莖進行繁殖，不僅繁殖率低，供不應求，而且消耗了很多的鱗莖。傳統的人工栽培通常采用分株繁殖，其繁殖率較低、周期長，不適宜用于商業化的規模種植，無法滿足市場需求，白及現已被列為中國30種稀缺瀕危天然藥物之一〔6〕。現已有很多學者在白及的組織培養技術，主要針對不同成熟度的白及種子的無菌萌發〔7-9〕、原球莖的生長發育〔10〕、無菌苗生長激素的篩選〔11〕以及最適合生根的相關激素配比等方面展開了研究。目前對白及種子的組織培養研究尚少，本實驗采用人工栽培和人工授粉的種子為實驗材料，運用植物組織培養技術，采用正交試驗，從培養條件、激素配比、有機物添加劑對白及的組織培養進行探索，希望能初步建立起白及組織培養繁殖體系，可以在短時間內獲得大量無菌種苗滿足市場需求，為白及的組培快繁及產業化栽培提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料實驗用材料選自云南人工栽培的成熟飽滿的白及蒴果。

1.2 方法

1.2.1 種子的春化處理 將成熟的白及蒴果置于4℃的冰箱中保存4 d，打破種子的休眠期，便于種子萌發。

1.2.2 蒴果滅菌與種子接種 成熟未裂開的白及蒴果表面先用洗衣粉水刷洗，再用流水沖洗蒴果約30 min。待表面水分被無菌濾紙吸干后先用75%酒精消毒1 min，再用0.1%的升汞溶液浸泡15 min〔12〕，期間不停搖動。消毒徹底后用無菌水沖洗4～6遍，無菌濾紙吸干表面水分后在無菌條件下用手術刀切開蒴果頂部，用鑷子將粉末狀種子直接抖落在培養基上，稍加搖動，使種子散布均勻，盡量鋪滿培養基表面。

1.2.3 白及種子的無菌萌發 以MS和1∕2MS為基本培養基，MS和1∕2MS培養基母液的配制及保存參考文獻〔13〕的方法。添加蔗糖30 g∕L，瓊脂9 g∕L以及不同濃度的生長調節劑6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），6-BA添加量見表1，pH 5.8，每種處理接種10瓶，分別置于光照培養室及暗培養室培養。

表1 白及種子萌發的不同培養基

1.2.4 白及無菌苗的增殖 以MS培養基為基礎培養基，采用L9（34）正交試驗研究3種對植物生長發育有重要作用的植物生長調節劑：6-BA、萘乙酸（NAA）、激動素（KT）對白及無菌苗增殖的影響，正交試驗各因素及水平見表2。每種處理接種10瓶，每瓶接種3株2 cm左右的種子萌發無菌幼苗（切除根），分別于光照培養室及暗培養室培養。

表2 白及無菌苗增殖試驗因素水平

1.2.5 白及無菌苗的生根培養 由于白及生根主要受NAA、赤霉酸（GA3）、番茄汁等因素的影響，為了研究白及無菌苗最佳生根培養條件，實驗以1∕2MS培養基為基本培養基，采用L9（34）正交試驗方法探討NAA、GA3、番茄汁等2種植物生長調節劑及1種天然復合物對白及無菌苗生根的影響，正交試驗各因素及水平見表3。每種處理接種10瓶，每瓶接種2株5 cm左右的無根幼苗。接種后的培養瓶放置到光照培養室培養，培養30 d時記錄實驗結果。

表3 白及無菌苗生根試驗因素水平

1.2.6 培養條件 實驗涉及的種子無菌萌發、無菌苗增殖及生根培養的光照培養條件為培養溫度（25±1）℃，光照強度2 000～2 500 lx，光周期12 h∕d；暗培養條件為全天無光照，溫度（25±1）℃。

1.2.7 數據分析方法 用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行處理，結合方差對實驗數據進行分析。

2 結果

2.1 不同實驗處理對白及種子萌發的影響種子萌發過程中，按表1光照處理1、4種子形態變化明顯，種子首先吸水膨脹，約5 d后種胚細胞開始分裂，橢圓形種子體積明顯增大；約13 d后突破種皮萌發出許多綠色的芽點，且處理4的長勢比處理1的長勢好，而此時暗處理種子均沒有明顯變化；20 d后暗處理1、4種子形態開始有所改變，而暗處理2、3、5、6種子表面顏色仍未見明顯變化，將其全部轉入光照培養室培養25 d后，處理1、4中的小苗長出3片葉子，其他處理也可見萌發跡象，出現綠色芽點。2個月后，1∕2MS培養基與MS培養基中的無菌苗高度相差不大，但MS培養基中有部分無菌苗出現枯萎及生長不良的現象，表明1∕2MS培養基種子萌發效果優于MS培養基。這主要是因為MS培養基中鹽溶液較1∕2MS培養基高，高濃度的鹽溶液對白及種子萌發會產生一定的毒害作用，1∕2MS培養基鹽分濃度相對較低，比較溫和，有利于萌發〔14〕，故選用1∕2MS培養基作為種子萌發的基本培養基。

結合6-BA添加量及光照條件等因素分析實驗結果發現，6-BA會抑制白及種子的萌發，因此不加任何激素的1∕2MS培養基結合適當光照條件更有利于白及種子的萌發，該實驗結果與宋曉丹等〔15〕的研究結果基本相似。但是袁寧等〔16〕通過對比1∕2MS培養基與1∕2MS+6-BA 1.0 mg∕L培養基認為6-BA有利于白及種子萌發，因此對于6-BA對白及種子萌發的影響還需要進一步實驗驗證。

2.2 不同激素配比對無菌苗增殖的影響按照正交試驗的方法，將2 cm左右無根的無菌苗接種到增殖培養基中，光照培養條件下，在培養13 d左右其基部開始膨大，分化出原球莖，無菌苗也緩慢長高，并變得粗壯，顏色濃綠。隨著培養時間的延長，原球莖上開始出現小芽點，并慢慢長成叢生芽，在培養40 d后對新生芽進行統計。見表4。實驗結果說明，NAA濃度（0.05 mg∕L）較低時有利于無菌苗叢生芽的誘導，6-BA和KT對叢生芽的誘導有促進作用，且對白及無菌苗增殖影響的主次順序為：NAA＞KT＞6-BA。誘導白及無菌苗增殖的較適組合為MS+6-BA 1.00 mg∕L+NAA 0.05 mg∕L+KT 1.00 mg∕L，此時白及無菌苗增殖系數達到1.83。但結合方差分析結果發現，6-BA、NAA和KT的F值均＜F0.05（2，8），即P＞0.05，表明各激素濃度變化差異無統計學意義，因此激素對于無菌苗增殖的具體影響還需要更深入的研究。見表5。

表4 不同激素對無菌苗增殖的影響

表5 不同激素對無菌苗增殖影響結果方差分析

2.3 不同濃度的添加劑對無菌苗生根的影響NAA屬于植物生長調節物中的生長素類，可促進植物根系的分化，常用于植物組織培養以促進無菌苗的生根培養。番茄汁中含有大量的糖類，可為植物細胞分裂分化提供碳源，為植物生根提供所需營養物質。番茄汁中還含有豐富的維生素C和維生素B，可促進外植體的生長和芽的生長。此外，番茄汁加入培養基中可使培養基顏色變深，為無菌苗的生根提供了暗環境，有利于根的生長。GA3可促進幼芽的生長，利于根莖的伸長，當GA3與番茄汁共同作用可促使植株生長健壯，根系發達，有利于移栽和煉苗。將4 cm左右的白及無根苗按正交試驗方法接入生根培養基中，10 d左右可看到小苗的基部開始長根，培養35 d后，拔出小苗進行觀察統計，正交試驗結果見表6。

實驗發現NAA 1.0 mg∕L生根效果好，生根率高，每株試管苗生根數多。當NAA濃度達到1.5 mg∕L時，對生根有一定的抑制作用，生根率降低，根系出現卷曲細小現象，根外部出現畸形。結合正交試驗結果分析發現，NAA對白及無菌苗生根影響最大，番茄汁次之，GA3影響最小。誘導生根的最佳組合為1∕2MS+NAA1.0mg∕L+GA31.5mg∕L+番茄汁200g∕L，此時生根率達100%，但根部粗壯卷曲，苗枯萎嚴重。這是因為番茄汁偏酸，使培養基pH降低，在調節pH過程中加入過多的堿，改變了培養基的相關成分，使培養基的滲透勢發生改變，最終導致試管苗枯萎。因此，綜合生根率和生長狀況，本實驗番茄汁較適濃度為100 g∕L。結合方差分析，NAA的F值＞F0.05（2，8），即P＜0.05，說明NAA濃度變化對實驗結果影響較大；而番茄汁和GA3的F值均＜F0.05（2，8），即P＞0.05，表明番茄汁和GA3的濃度變化對實驗結果影響不顯著。見表7。

表6 不同因素對無菌苗生根的影響

表7 不同因素對無菌苗生根影響結果方差分析

綜上，本實驗以白及成熟蒴果為外植體對白及組織培養進行了研究。實驗結果發現，1∕2MS培養基和適當的光照可使種子萌發速度快，長勢好。在增殖過程中，NAA對白及的增殖影響最大，其次是KT，最優組合為MS+6-BA 1.00 mg∕L+NAA 0.05 mg∕L+KT 1.00 mg∕L，增殖系數達到1.83。生根過程中，NAA的濃度對生根率和每株試管苗生根數影響最大，本實驗中白及生根的最優組合為1∕2MS+NAA 1.0 mg∕L+GA30.5 mg∕L+番茄汁100 g∕L。