UPLC法同時測定何首烏中2個蒽醌糖苷

母茂君，李 楊，李成功，劉 衡，譚 鵬，周 濃，張海珠，*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；3.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045；4.重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120）

何首烏又稱赤首烏、馬肝石等，始載于《開寶本草》，是蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，主產于湖北、貴州、四川等地。根據炮制方法不同分為生首烏和制首烏，生首烏具有截瘧、潤腸通便的功效；制首烏具有補肝腎、益精血的功效〔1〕。民間常用作為補腎烏發、延年益壽之藥。何首烏中主要含蒽醌類、二苯乙烯苷類和磷脂類成分〔2〕。現代研究表明何首烏中的結合性蒽醌，如大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷具有益智、抗衰老和促進學習記憶作用〔3-4〕。目前有關何首烏藥理作用及機制研究的報道較多，但是有關何首烏中蒽醌糖苷定量方法的研究較少，阻礙了何首烏的質量標準提升。

本研究基于超高效液相色譜法建立何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量同時測定方法，并對不同產地的何首烏藥材中的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷進行了定量檢測，考察其含量分布的差異性，以期為何首烏藥材的質量評控提供一種新的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，美國Waters公司，配備有二極管陣列檢測器，自動進樣器，Empower 2色譜工作站；XS-205電子天平，AL-204電子天平，METTLER TOLEDO公司；超聲儀，南京新辰生物科技有限公司，40 KHz。

1.2 試藥大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號23313-21-5，純度以98.45%計，由深圳菲斯化工有限公司提供）；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號131012，純度以98.41%計，由成都克洛瑪生物科技公司提供）。甲醇、磷酸為色譜純，美國Fisher公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材16批次何首烏藥材購買于不同省份，粉碎，過四號篩，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗以WatersBEHC18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）為分離柱，VanGuard Pre-Column（1.7μm，2.1mm×5mm）為保護柱；以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相；流速為0.2 mL∕min；梯度洗脫條件為：0～5 min：55→63（A），5～9 min：63→70（A）；檢測波長為280 nm；柱溫為30℃；理論塔板數按大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰計算應不低于7 000。

2.2 對照品溶液的制備以色譜級甲醇作溶劑，精密稱取大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，配制成濃度為66、48 μg∕mL的混合對照品溶液（先用0.5 mL二甲基亞砜溶解，再用甲醇定容至刻度）。

2.3 供試品溶液的制備取何首烏藥材粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 儀器精密度考察取混合對照品溶液，按上述含量測定方法連續進樣6次，每次2 μL，記錄峰面積，計算RSD值。結果大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD為0.53%，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD為1.15%，表明儀器的精密度良好。

2.5 線性關系考察取混合對照品溶液，分別精密吸取對照品混合液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測得峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y）繪制標準曲線。結果表明，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷一次進樣量在0.033～0.198 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程和相關系數為Y=9.8×105X-1 462，r=0.999 5；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷進樣量在0.024～0.144 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程和相關系數為：Y=6.4×105X-1 148，r=0.999 1。

2.6 重復性考察取同一批供試品（6號供試品）粉末0.20 g，共6份，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，進樣測定，每次2 μL，記錄峰面積，計算含量。結果樣品中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為0.42%，RSD為1.27%；大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量的平均值為0.18%，RSD為1.86%；表明供試品含量測定重復性良好。

2.7 準確度考察（加樣回收率試驗）取錐形瓶6個，分別精密加入新配制的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液（66 μg∕mL）6.36 mL、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液（48 μg∕mL）3.75 mL，減壓回收溶劑至干，再精密稱取已知含量供試品（6號供試品粉末，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量為4.2 mg∕g，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖含量為1.8 mg∕g），各稱取約0.10 g，分別精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液。進樣測定，按下式計算回收率。

測定結果為6份供試品中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的平均加樣回收率分別為98.44%、95.37%，RSD分別為1.35%、2.41%，表明本方法具有較好的回收率，測定方法可靠。

2.8 供試品溶液穩定性考察取“2.3”項下供試品溶液，間隔0、2、4、8、16、24 h測定1次，進樣2 μL，記錄峰面積，計算RSD。結果大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的RSD為0.76%，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的RSD為0.89%，表明供試品溶液在24 h內穩定，能滿足測定需要。

2.9 供試品含量測定取不同產地何首烏藥材粉末各0.20 g，按“2.3”項下制備樣品溶液，進樣2 μL，記錄峰面積，計算樣品中的含量。見表1。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

表1 不同產地何首烏藥材供試品含量測定結果（n=3，%）

圖1 對照品溶液（A）與供試品溶液（B）的UPLC圖

3 討論

實驗過程中對混合對照品溶液采用DAD檢測器在200～410 nm波長內掃描，結果顯示大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷在281 nm處具有最大吸收，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷在271 nm處具有最大吸收。實驗過程中分別以乙腈-0.1%磷酸水溶液（30：70）、甲醇-0.1%磷酸水溶液（55：45）、甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相；流速為0.2 mL∕min；柱溫為25、30、35℃，分別進行試驗研究。綜合考慮供試品中雜質對目標峰峰純度的干擾、基線噪音、出峰時間及色譜峰形的優化，最終選擇上述梯度洗脫條件，檢測波長280 nm，在該色譜條件下，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷與雜質峰分離效果良好，保留時間適中；通過二級管陣列檢測器對供試品峰純度檢測，峰純度角度小于峰純度閾值，均為符合要求的純峰，峰純度檢測見圖2。

圖2 供試品中色譜峰純度圖

測定結果顯示，16批次不同產地的何首烏藥材中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量差異較大，從貴州遵義購買的1批野生何首烏藥材（6號供試品）中含量最高達到0.42%，而從云南、貴州購買的2批野生何首烏藥材（8、9號供試品）未檢測出大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷。另外從何首烏藥材中大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量來看，普遍在0.2%以下甚至未檢測出。或許這暗示可以用大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷作為指標性成分來區分何首烏藥材品質的優劣。

由于近年來不斷出現服用何首烏導致肝損傷病例的報道〔5-6〕，引起社會的廣泛關注，藥學工作者對其肝損傷機制機理也作了大量研究〔7-11〕。目前對何首烏藥材的藥理作用和質量控制研究大多集中在二苯乙烯苷類成分上，對何首烏中結合性蒽醌苷類定量檢測的研究甚少。如何更加科學地評控何首烏藥材的質量對保障臨床安全用藥具有重要的意義。何首烏作為傳統補益類中藥，亟須建立跟其補益功效相關的指標性成分的含量測定方法。2015年版《中華人民共和國藥典》通過間接法測定結合蒽醌的含量顯得比較繁瑣〔12〕，本實驗首次建立了超高效液相色譜法同時直接測定何首烏藥材中2個結合性蒽醌糖苷含量的方法，該法簡便、精確、快速，能在6 min內快速完成2個成分的含量測定，為何首烏藥材的質量控制提供了一個參考方法。