表皮生長因子受體突變非小細胞肺癌耐藥機制的研究進展

施純子， 黃 鋼

1. 上海中醫藥大學研究生院，上海 201203 2. 上海健康醫學院，上海 201318 3. 上海中醫藥大學，上海 201203

美國癌癥學會《2018年全球癌癥統計數據》報告，2018年新發肺癌近210萬，死亡176萬，新發病率、病死率分別為11.6%和18.4%[1]。肺癌發病率和死亡率均居全球各類癌癥首位。

按組織學特征，肺癌現可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)兩類。其中NSCLC占80%，主要為腺鱗癌及大細胞癌[2]。Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者的5年生存率遠低于其他癌癥，為15%～19%，晚期伴轉移患者生存率僅為4%[3]。

早期肺癌臨床表現缺乏特異性，檢查和診斷多依賴高分辨率CT及患者定期隨訪。因此，NSCLC的早期診斷率不高。針對Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者，臨床多采用放化療聯合治療，但放化療引起的不良反應較多，且部分患者對治療敏感性較差，導致患者生存質量及預后較差。

NSCLC患者表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變的發現，及其酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)靶向治療方法的問世，使經驗細胞毒性化療轉變為分子靶向癌癥治療的模式。

盡管早期EGFR-TKIs的應用改善了該類肺癌患者的生存率及預后，但耐藥現象的存在及癌癥進展限制了多數患者的獲益。肺腺癌伴EGFR突變的患者中，有5%～10%對EGFR-TKIs發生了原發性耐藥；同時，對EGFR-TKIs敏感的患者在治療8～16個月后，出現繼發性耐藥[4-6]。因此，近10年，EGFR-TKIs的耐藥機制及解決方法成為研究熱點[7]。

1 EGFR-TKIs作用原理及發展史

EGFR屬酪氨酸激酶I型受體家族，其基因定位于人第7號染色體的短臂，常在多種上皮細胞腫瘤中表達。EGFR-TKIs作用機制主要為選擇性結合EGFR細胞內酪氨酸激酶域的三磷酸腺苷(ATP)結合位點，阻斷EGFR分子內酪氨酸自身磷酸化，進而抑制EGFR下游信號通路，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移，腫瘤內新生血管生成及組織表型轉化[8]。EGFR下游通路包括RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT和JAK/STAT通路[9]。

然而，第1代藥物與酪氨酸激酶結構域的結合是可逆的。針對該缺點，第2代EGFR-TKIs(阿法替尼、達克替尼)進行了改進，其能與EGFR共價結合，不可逆地中斷信號傳導，從而帶來持續且廣譜的抗腫瘤活性。盡管第1、2代EGFT-TKIs均使患者中位緩解時間延長，但仍有超過60%的患者對其發生耐藥。第3代EGFR-TKIs(奧西替尼、洛昔替尼)不僅能不可逆地與酪氨酸激酶結合，且具有高度選擇性，可有效對抗EGFR-TKIs繼發性耐藥。

2 原發性耐藥機制

原發性耐藥是指伴有EGFR突變的NSCLC患者在接受EGFR-TKIs治療后的90 d內無客觀反應且病情進展。原發性耐藥機制主要概括為以下幾方面。

2.1 BIM基因多態性缺失 BIM基因是B細胞淋巴瘤-2(BCL-2)蛋白家族成員之一，具有促凋亡作用。東亞人群中BIM基因多態性缺失可導致活性BIM蛋白表達下調或無活性BIM增多，使EGFR-TKIs無法通過BIM蛋白介導而引起腫瘤細胞凋亡[10-11]。Ng等[12]發現,EGFR突變NSCLC患者中，BIM表達水平與EGFR-TKIs療效呈正相關，BIM多態性缺失是TKIs原發性耐藥的分子機制之一。

2.2 體細胞單核苷酸突變 Zhong等[13]用新一代測序技術(NGS)分析11例EGFR-TKIs原發性耐藥患者的基因情況后首次發現，單核苷酸突變模式與其原發耐藥相關聯，其中原發耐藥組DNA點突變頻率(51.3%)高于敏感組(43.6%)，主要突變為胸腺嘧啶替代胞嘧啶、腺嘌呤替代鳥嘌呤，提示堿基的環外氨基自發脫落導致的單核苷酸轉換是EGFR-TKIs原發性耐藥的潛在機制。

2.3 EGFR基因的共存突變 EGFR-TKIs對攜帶常見敏感突變的(如L858R突變)NSCLC患者療效較理想?；驕y序發現，EGFR敏感突變與耐藥突變共存也是引發耐藥的機制之一。耐藥突變包括EGFR L858M(外顯子21)、L11F(外顯子1)、G719A(外顯子18)和T790M(外顯子20)突變[13]。以往，T790M突變被認為是繼發性耐藥的主要原因，現發現其也與原發性耐藥相關。此外，EGFR突變還可與KRAS突變共存(小于1%)，或與ALK重排共存(小于2%)[14-15]。這些耐藥突變可以阻滯EGFR-TKIs與EGFR靶部位結合[16-17]。

2.4 下游信號通路異常啟動及旁路途徑代償性激活 當上游EGFR通路激活受阻時，腫瘤細胞可利用EGFR下游信號通路分子代償性激活其他信號通路或通過信號通路間的交互作用而維持EGFR下游通路的持續激活，促使腫瘤細胞生長、侵襲和轉移。

2.4.1 MET擴增 C-MET原癌基因編碼的蛋白質產物MET是肝細胞生長因子的特異性受體(HGFR)，具有酪氨酸激酶活性，與多種癌基因產物和調節蛋白相關。HGF與HGFR結合可誘導多種細胞的多效性生物學效應，包括有絲分裂活性、原動力活性、形態活性和抗凋亡活性[18]。C-MET原癌基因擴增，使MET的配體HGF可以持續磷酸化MET，恢復PI3K/AKT信號通路，誘導EGFR突變的肺腺癌細胞對吉非替尼產生耐藥性[19-20]。這一機制可能與吉非替尼的原發和繼發性耐藥均有關[21-22]。

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2.4.2 PTEN缺失 PTEN是一種抑癌基因，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)基因家族成員。PTEN通過去磷酸化PI-(3,4,5)-三磷酸參與細胞調控，介導AKT的活化，從而負調控PI3K/AKT/mTOR通路，導致G1期阻滯，促進腫瘤細胞凋亡。研究[23]表明,EGFR突變的細胞中PTEN表達下調或缺失時，下游通路PI3K/AKT被異常激活，過表達的AKT使腫瘤細胞可以抵抗凋亡進程。由PTEN丟失引起的PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制可能是EGFR敏感突變NSCLC患者對EGFR-TKIs繼發性耐藥的機制之一[24-25]。

2.5 TP53突變 TP53基因又稱為p53基因，是公認的抑癌基因，其重要作用之一是調控細胞分裂和增殖。研究[26]顯示，50%～60%的晚期EGFR突變肺癌患者發生TP53突變。TP53功能的缺失使腫瘤的侵襲性增加且對EGFR-TKIs敏感性降低，也是原發性耐藥機制之一[27]。此外，突變TP53還能通過激活轉錄因子EGR-1，促進Cathepsin L入核并過表達，繼而促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，調節腫瘤細胞的侵襲遷移能力[28]。

2.6 神經纖維蛋白1(NF1)表達的降低 de Bruin等[29]通過對人類肺癌細胞系全基因組siRNA和對小鼠EGFR突變型肺腺癌的分析，發現厄洛替尼耐藥性與NF1表達降低有關。NF1是由NF1基因編碼的RAS GTP酶激活蛋白。當NF1水平降低時，厄洛替尼對RAS/RAF/MEK/ERK信號抑制減弱；MEK抑制劑可使治療NF1表達降低的肺腺癌患者對厄洛替尼的敏感性恢復。該結果表明，低水平的NF1表達與肺腺癌患者對EGFR-TKIs的原發性和繼發性耐藥均有關。

2.7 其他潛在的突變相關機制 Zhong等[13]通過對原發性耐藥患者進行基因測序發現，耐藥患者存在以下獨特的高頻率突變。(1)泛素E3連接酶環指43 (RNF43)失活突變：RNF43具有E3泛素化連接酶活性，通過對Wnt膜受體的清除能力發揮負向調控效應。RNF43的失活突變使Wnt通路異常過度激活，促進腫瘤的發生。研究[30-31]證實,在胰腺囊性腫瘤、結直腸癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中存在高頻RNF43失活突變。(2)MYC擴增：MYC是一種調控基因，在細胞周期進程、凋亡、轉化等過程中發揮重要作用。測序結果[13]顯示，原發性耐藥患者基因的MYC擴增率(13.6倍)明顯高于對EGFR-TKIs藥物敏感的患者(2.9～4.8倍)。MYC擴增可能是肺腺癌患者無病生存率和總體生存率的獨立不良預后因素，且MYC抑制劑最近已被用于臨床前研究[32-33]。這兩種突變可能與EGFR-TKIs原發耐藥相關，但機制仍需進一步研究證實。

2.8 組織學改變 上皮間質轉化(EMT)主要參與胚胎發育過程中的細胞分化, 是一種重要的生理現象。EMT主要表現為上皮細胞極性特征的改變，涉及細胞間連接和細胞器分布狀態等，可使腫瘤細胞具備轉移及侵襲能力，加劇腫瘤的病程進展[14]。CRIPTO1也稱為TDGF1(生長因子1)是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)相關細胞膜固定點蛋白，屬于EGF-CFC家族，能通過激活ZEB1和SRC減弱肺癌患者對EGFR-TKIs的敏感性,促進EMT的發生[34]。

3 繼發性耐藥機制

繼發性耐藥：(1)繼發性耐藥患者曾接受過單一EGFR-TKIs抑制劑的治療；(2)EGFR -TKIs治療伴EGFR突變腫瘤的敏感性與客觀臨床療效相關，患者從治療中獲益，得到部分緩解(PR)或完全緩解(CR)，或明顯且持久的(≥6個月)臨床療效；(3)疾病系統性進展;(4)在EGFR-TKIs治療和新療法之間未進行其他系統治療[7]。

3.1 EGFR繼發突變 NSCLC患者中最常見的EGFR-TKIs繼發性耐藥機制為第20號外顯子的T790M突變，約占繼發性耐藥患者的50%[35-36]。其耐藥的可能機制：(1)在790位點，蛋氨酸(M)替代蘇氨酸(T)，使EGFR與ATP結合力降低[37]。蛋氨酸雖然形成空間位阻，但不影響ATP和酪氨酸激酶的結合，使酪氨酸激酶磷酸化狀態得以維持。(2)T790M突變增加了EGFR與ATP結合的親和力，使EGFR-TKIs與EGFR結合被ATP競爭性結合取代。

EGFR-C797S突變是第3代EGFR-TKIs主要的耐藥機制。奧希替尼與半胱氨酸C797在 ATP 結合位點形成共價鍵，而C797S突變影響共價鍵的形成，導致EGFR-TKIs失效，此時EGFR下游通路仍處于激活狀態[38]。

此外，D761Y(19號外顯子)、T854A (21號外顯子)[39]和L747S(19號外顯子)突變[40]近年來也被證實與EGFR-TKIs繼發性耐藥有關。

3.2 下游信號通路激活及旁路途徑異常激活 除MET擴增、PTEN缺失、NF1表達的降低外，NSCLC也可能通過下述EGFR下游信號蛋白基因突變或異常激活對EGFR-TKIs產生繼發性耐藥。

3.2.1 胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)介導的 EGFR 下游通路異常激活 IGF-1R作為一種跨膜蛋白，對腫瘤細胞增殖、基因轉換等都起重要作用，其激活可異常激活RAS/RAF/MAPK及PI3K/AKT信號轉導通路。NSCLC患者中普遍存在EGFR基因的過表達，同時伴隨IGF-1R的高表達。IGF-1R過表達可維持PI3K/AKT信號通路激活，從而介導患者對EGFR-TKIs的耐藥。研究[41-42]發現，EGFR-TKIs治療的腫瘤細胞中IGF結合蛋白(IGFBPs)表達缺失，使IGF-IR活性增加，進而介導了EGFR-TKIs的耐藥性。研究[43]發現， IGF-1R基因在整體肺癌患者中突變頻率較低，卻在鱗癌和腺癌患者中呈高表達狀態。而在肺腺癌患者中，IGF-1R過表達者生存期較低表達者明顯縮短[44]。

3.2.2 AXL過表達或異常激活 AXL屬于RTK的Tyro/ AXL /Mer (TAM)家族。生長抑制特異性蛋白6 (GAS6)是AXL的配體。AXL激活后通過多種下游途徑促進細胞遷移、聚集和生長。AXL在獲得對埃洛替尼耐藥的EGFR突變型NSCLC異種移植瘤模型中過表達[45]。Lee等[46]發現,AXL表達上調可異常激活AKT、MAPK或NF-κB信號通路，促進埃羅替尼的耐藥發生，還可能與EMT相關。

3.2.3 白介素6(IL-6)過度分泌 IL-6在多種慢性炎癥疾病中發揮重要作用，參與腫瘤生長和轉移、擴散的調控。IL-6R/JAK1/STAT3通路的激活可誘導伴T790M突變的NSCLC患者對第2代及3代EGFR-TKIs產生耐藥性[47]。此外，旁分泌或自分泌刺激TGF-β軸也會增加IL-6的分泌，促進EGFR-TKIs耐藥的發生[48]。

3.2.4 CRK樣基因(CRKL)擴增 CRKL是一種適配蛋白，受到細胞內外因子(如生長因子、細胞因子或BCR-ABL融合蛋白)刺激后，參與信號轉導。CRKL可激活SOS1/RAS/RAF/ERK和SRC/C3G/RAP1通路。EGFR突變的肺癌細胞中，CRKL擴增后通過激活ERK和AKT信號蛋白誘導細胞對吉非替尼的耐藥[49]。

3.2.5 PIK3CA突變 PIK3CA是PI3K催化亞基的編碼基因，在多種腫瘤中發生突變或擴增。研究[50-51]表明，PIK3CA突變常與EGFR或K-RAS突變共存，介導EGFR-TKIs耐藥，但其作用機制仍需進一步探究。

3.2.6 HER2擴增 HER2在EGFR-TKIs敏感的EGFR突變細胞中經厄洛替尼處理后呈磷酸化形式。利用小干擾RNA(siRNA)下調HER2表達后，EGFR突變細胞株的生長受到進一步抑制。HER2過表達或敲除分別使伴EGFR突變的細胞系模型表現出耐藥性和敏感性?；蚪M拷貝數分析[52]表明，HER2在小鼠和人類腫瘤中均有擴增，其通過與激活的EGFR結合，激活下游信號，調控細胞增殖和遷移。HER2可能是EGFR-TKIs耐藥細胞的耐藥介質[39]。

3.3 血管生成途徑分子表達異常 腫瘤異常生長和轉移是其重要特征，而新生血管生成是該特征實現的重要途徑。血管功能受損和組織缺氧可導致腫瘤轉移及耐藥性增加[35]。

EGFR信號的激活可以增加血管內皮生長因子(VEGF)的表達。VEGF家族及其受體是血管生成和血管通透性的重要調控因子[53]。腫瘤細胞中血管內皮生長因子受體1(VEGFR-1)過表達導致腫瘤細胞存活和侵襲性增加[54]。VEGF可能抑制腫瘤對EGFR-TKIs敏感性，降低其抗腫瘤作用。Bianco等[55]發現，VEGF/VEGFR系統通過EGFR獨立機制激活下游信號通路，與EGFR-TKIs的耐藥性相關。

成纖維細胞生長因子(FGF)及其受體(FGFRs)也參與腫瘤組織血管的形成。FGFR2和FGFR3能介導FGF2和FGF7刺激的細胞外調節蛋白激酶ERK活化，降低細胞對EGFR-TKIs的敏感性[56]。FGFR激活是肺癌細胞對阿法替尼耐藥的一種逃逸機制[57]。

4 組織學改變

4.1 EMT EMT不僅與原發性耐藥有關，還與體外對EGFR-TKIs的繼發性耐藥有關[58-59]。VEGFR-1通過誘導EMT，在癌癥進展中發揮作用[53]。VEGFR-1的激活導致EMT相關轉錄因子的表達增加。IL-8[8]、Notch-1[60]、SOX9[61]等因子與EMT相關。

4.2 NSCLC轉化為SCLC 盡管NSCLC和SCLC病理學特征和基因組不同，但其可能具有共同的細胞來源。對EGFR-TKIs耐藥的患者中存在NSCLC轉化為SCLC的現象[13]。RB1的失活在SCLC的發生發展中起重要作用，RB1的突變或丟失在人類SCLC腫瘤中被發現[62]。

綜上所述，肺癌是全球人群健康的主要威脅之一，也是醫學研究領域需要攻克的堡壘。隨著基因測序技術的成熟、多層組學整合及生物信息學的發展，肺癌的治療手段得到了很大發展。除常規的手術、放療、化療外，分子靶向治療、基因治療和免疫治療為其提供了新思路。然而,耐藥的產生限制了藥物的療效及患者的預后。因此，肺癌耐藥機制及逆轉耐藥的研究對于臨床治療具有重大意義。耐藥機制的突破將使肺癌的治療更高效，增加患者獲益。