豬δ冠狀病毒的病原學特征及檢測技術研究進展

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.濱州貝爾凱瑞生物技術有限公司，濱州 256600）

豬δ冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是近年來新發現的一種能夠引起豬只嚴重水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬死亡的豬腸道冠狀病毒。其臨床癥狀及病理變化與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等均非常相似，臨床上很難區分，若不加以預防和控制，將會給養豬業造成重大損失。因此，加強該病毒的研究與防控，建立快速有效的病毒檢測技術非常關鍵。本文對PDCoV的發現、病原學特征、培養特性及檢測技術研究進展等方面進行了綜述，以期為更好地診斷和防控本病提供參考。

1 病毒的由來和發現

PDCoV最早于2012年由中國香港的研究人員在鑒定哺乳動物與禽類的新冠狀病毒時被首次發現。2014年在美國腹瀉仔豬和母豬的糞便中首次被成功檢測并分離到，隨后陸續在加拿大、韓國、中國大陸和泰國等國家被檢出[1]。Dong等（2015）[2]對2013—2014年間采自我國湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等省市規模化豬場的258份糞便樣品進行檢測，共檢測到21份陽性樣品，陽性率為14.3%，首次證實PDCoV在我國豬場中存在。

2 病毒的分類地位

PDCoV屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬成員。冠狀病毒科分為α、β、γ以及δ冠狀病毒屬共4個屬。α和β冠狀病毒屬主要由哺乳動物冠狀病毒組成，γ冠狀病毒屬主要包括鳥類冠狀病毒，而δ冠狀病毒屬既包括哺乳動物冠狀病毒，也含有鳥類冠狀病毒[3]。PEDV和TGEV均屬于α冠狀病毒屬。δ冠狀病毒屬最初只在禽類體內發現。

3 病毒的病原學特征

3.1 病毒的形態特征

PDCoV病毒粒子結構與其他冠狀病毒相似，呈典型的冠狀病毒形態。電鏡觀察顯示，PDCoV病毒粒子呈球形，直徑約為120～180 nm，具有囊膜、纖突。

3.2 病毒的基因組結構及功能

PDCoV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組結構與PEDV相似，全長約為25.4 kb，是目前已知冠狀病毒家族中基因組長度最小的病毒。PDCoV具有5′端帽子結構和3′端Poly（A）尾巴。共編碼 4種結構蛋白，即纖突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和4種非結構蛋白[1]。N蛋白是冠狀病毒中一種多功能磷酸化的結構蛋白，是冠狀病毒在感染細胞中產生最多的病毒蛋白之一，結構具有保守性和種屬特異性。利用冠狀病毒N蛋白這一特性，可用于建立高效、準確、快速的分子生物學檢測技術。S蛋白是受體結合位點、溶細胞作用和主要抗原位點。E蛋白較小，是負責病毒與包膜結合的蛋白。M蛋白負責營養物質的跨膜運輸、新生病毒出芽釋放與病毒外包膜的形成。

3.3 病毒的培養特性

Hu等（2015）[4]對PDCoV分離及細胞適應性進行了較為詳細的研究發現，PDCoV可以在豬睪丸細胞（ST）和豬腎小管上皮細胞（LLC-PK）上生長與傳代，并產生明顯的細胞病變（CPE），表現為細胞變圓、聚集，最后脫落。在病毒分離和培養過程中，需要添加胰酶、胰液素或未感染仔豬的小腸內容物（SIC）。若培養基不加胰酶處理，病毒在LLC-PK細胞上仍能復制生長，但不會產生CPE，而且病毒滴度也比較低。其認為胰酶或SIC是病毒培養過程中非常重要的因素，可能通過影響病毒與受體結合、病毒進入細胞或者復制的某個階段，從而促進病毒的復制以及CPE的產生。這表明PDCoV與PEDV在病毒入侵細胞以及病毒復制過程中有相似的機制。

4 病毒的流行病學與致病性

PDCoV是豬的一種腸道疾病病原，病毒感染仔豬后盡管出現腹瀉和脫水，但其食欲一般不受影響，且體溫保持正常。PDCoV主要感染部位在小腸上皮細胞，剖檢可見小腸上皮損傷和腸絨毛脫落等病變，這與PEDV、TGEV感染仔豬后的剖檢變化極為相似。

5 病毒檢測技術研究進展

5.1 病毒的分離培養

目前對于PDCoV的分離培養，主要采用LLCPK和ST細胞。國內陳建飛等（2016）[5]將黑龍江某

收稿日期：2017-11-17

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-08-17）

作者簡介：莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，副研究員，碩士，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制.E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com豬場的PDCoV陽性樣品無菌處理后接種LLC-PK細胞并連續傳代培養，成功分離到國內首株PDCoV并將其命名為NH株。M基因的系統發育分析表明，NH株與中國、美國及韓國的PDCoV親源關系較近。

5.2 血清學檢測技術

5.2.1 ELISA（酶聯免疫吸附試驗） Ma等（2015）[6]以PDCoV全病毒作為包被抗原建立了間接ELISA方法。Thachil等（2015）[7]建立了以原核表達純化的PDCoV S蛋白為包被抗原的間接ELISA方法。通過對已知的210份血清樣本進行PDCoV抗體檢測，得出該方法的敏感性和特異性分別為90.6%和94.8%。對355份血清樣品進行檢測，陽性率為8.7%。國內張帆帆等（2016）[8]、蘇明俊（2017）[9]、逄鳳嬌等（2017）[10]先后建立了以原核表達的PDCoV N蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法，并應用建立的方法進行了大量血清學檢測，表明我國不同地區豬群中都存在PDCoV感染，為PDCoV的流行病學調查及防控提供了重要依據。

5.2.2 其他血清學方法 Chen等（2015）[11]、Hu等（2015）[4]、Okda 等（2016）[12]先后應用間接免疫熒光法（IFA）在PDCoV病毒分離過程中檢測培養細胞中病毒的存在。Chen 等（2015）[11]以兔抗 PDCoV M、N和S蛋白抗體作為一抗建立了PDCoV組織免疫化學分析法（IHC），并利用該方法分析了PDCoV感染豬的組織，結果顯示PDCoV主要集中在空腸中段、末端及回腸部位，說明PDCoV對此部位較為敏感，為PDCoV的臨床診斷、組織分布以及致病機理研究奠定了基礎。Jung等（2015）[13]建立的原位雜交（ISH）和免疫熒光染色法，對PDCoV感染豬后在組織中的復制位點進行了測定，結果顯示PDCoV在豬的整個腸道引起急性感染，但病毒最先在空腸和回腸部位進行復制。Okda等（2016）[12]采用建立的ELISA和熒光微球免疫檢測法（FMIA）方法對PDCoV感染豬的血清抗體動力學進行了初步研究，實驗室感染條件下，兩種方法的檢測結果均表明PDCoV血清抗體轉換發生在感染后8～14 d。

5.3 分子生物學檢測技術

5.3.1 RT-PCR技術 目前已建立的PDCoV特異性RT-PCR，都是針對M基因或N基因保守區域的。在PDCoV流行初期，Wang等（2014）[14]根據香港株PDCoV HKU15-155的M基因和N基因為靶基因設計特異性引物建立了RT-PCR方法，首次確定了PDCoV在美國的出現。Sinha等（2015）[15]采用RT-PCR對來自美國18個州的1 734份樣本的檢測結果證明至少在2013年8月就已經存在PDCoV。逄鳳嬌等（2016）[16]根據PDCoV M基因建立的RT-PCR方法，最低檢測限達 6.33×104拷貝/μL。鄭麗等（2017）[17]根據PDCoV M基因建立了RT-PCR方法，對110份臨床樣品進行檢測，陽性檢出率為11.8%。張帆帆等（2016）[18]根據PDCoV N基因建立RT-PCR方法，最低能檢測到1.0×103拷貝/μL。陳建飛等（2016）根據PDCoV E蛋白和M蛋白基因設計引物建立了RT-PCR方法，對2014年1月至2015年11月收集的77個豬場的232份臨床腹瀉樣品進行了RT-PCR 檢測，PDCoV 陽性率達 10.34%（24/232）。Song等（2015）[19]以 PDCoV N基因為靶基因建立了巢式RT-PCR方法，應用該法對2012年11月至2015年3月在江西采集的356份豬糞便或腸道樣本進行檢測發現，PDCoV陽性樣品高達33.71%，PDCoV與PEDV共同感染率為19.66%。由于PDCoV與PEDV引起的臨床癥狀極為相似，在普通實驗室很難進行準確的診斷，因此建立一種針對兩種病毒的診斷方法是非常必要的。Zhang等（2016）[20]在傳統RT-PCR基礎上以PDCoV和PEDV的M基因作為靶基因建立了一種針對PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR。其中對PEDV的檢測限為7個RNA拷貝，對PDCoV的檢測限為14個RNA拷貝。劉玲玲等（2016）[21]根據PDCoV N基因和TGEV N基因序列設計引物建立了能同時檢測PDCoV和TGEV的雙重RT-PCR方法。用建立的該雙重RT-PCR方法對252份臨床樣品進行檢測，檢出PDCoV陽性樣品31份，陽性率為12.30%，TGEV陽性樣品12份，陽性率為4.76%，同時感染PDCoV和TGEV的陽性樣品2份，陽性率為 0.79%。韓麗等（2017）[22]根據 PDCoV N基因和PEDV M基因序列設計引物，建立了能同時檢測PDCoV和PEDV的雙重RT-PCR方法。用建立的該雙重RT-PCR方法對111份臨床樣品進行檢測，其中PDCoV陽性樣品22份，陽性率為19.82%，PEDV陽性樣品27份，陽性率為24.32%，PDCoV和PEDV共感染的樣品數為10份，陽性率為9.01%。任玉鵬等（2016）[23]建立了同時檢測PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立，應用該法對222份腹瀉樣品的檢測結果表明，PEDV陽性檢出率為52.2%、PDCoV為2.7%、TGEV為2.3%。雙重或多重RT-PCR方法能夠快速、準確地對PDCoV、PEDV和TGEV等單一或混合感染的臨床樣品進行快速檢測，為臨床上對豬病毒性腹瀉鑒別診斷和流行病學調查研究提供了新的技術手段。

5.3.2 熒光定量RT-PCR技術 實時熒光定量RT-PCR比常規RT-PCR具有更高的優勢，在PDCoV的檢測方面也取得了進展。Marthaler等（2014）[24]針對PDCoV的ORF1、S1和M基因設計引物并建立了TaqMan熒光定量RT-PCR方法，結果表明M基因引物的靈敏度高且穩定性好。Chen等（2015）[11]、Zhang等（2016）[20]也先后針對PDCoV的M基因建立了TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法。張利衛等（2017）[25]根據PDCoV M基因序列設計引物，建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法。應用該法對臨床198份臨床腹瀉樣品進行檢測，陽性率為 20.71%（41/198）。Ma等（2015）[6]、肖帥等（2017）[26]先后根據PDCoV N基因設計引物，建立了PDCoV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。熒光定量RT-PCR方法，能在豬發病早期或病毒隱性感染時進行確診和實時監測，不僅可以應用于PDCoV的流行病學調查，也將為PDCoV的定量檢測和快速診斷提供有力的技術手段。

6 小結

PDCoV的傳播給世界養豬業帶來了嚴重的經濟損失，引起了人們的關注。目前尚無針對PDCoV的商品化疫苗、特效治療藥物和防治方法，人們對PDCoV的認識也比較匱乏，與其他引起腹瀉的病毒相比，PDCoV的診斷和檢測工具尚處于發展階段，但隨著人們對PDCoV研究的不斷深入，尤其是對其致病機制和免疫機理的深入了解，相信在不久的將來，PDCoV的疫苗和更加簡便、有效的檢測技術都會相繼面世，以用于控制該病的發生與流行。