轉基因作物快速檢測技術進展與展望

梁晉剛 徐俊鋒 焦悅 劉鵬程 張秀杰

摘要：轉基因檢測作為轉基因生物安全評價、監(jiān)管和標識管理的重要支撐，可有效防范未經安全評價和品種審定的轉基因作物非法擴散，保障我國農業(yè)轉基因生物產業(yè)健康發(fā)展。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，轉基因檢測技術也在朝著快速、簡便、高通量、自動化等方向發(fā)展，轉基因快速檢測技術越來越得到廣泛運用并在監(jiān)管過程中發(fā)揮了重要作用。本文簡要介紹了轉基因作物快速檢測技術的發(fā)展現(xiàn)狀，并討論了幾種快速檢測技術存在的問題，最后總結歸納了轉基因作物檢測存在的新問題，為我國轉基因作物的安全監(jiān)管提供參考。

關鍵詞：轉基因作物;快速檢測技術;監(jiān)管;研究進展;展望

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0071-04

收稿日期：2018-07-24

基金項目：轉基因生物新品種培育科技重大專項（編號：2016ZX08011-003）。

作者簡介：梁晉剛（1987—），男，山西陽泉人，博士，農藝師，主要從事轉基因生物安全評價與檢測研究。E-mail：382408162@qq.com。

通信作者：張秀杰，副研究員，主要從事轉基因生物安全評價與檢測研究。E-mail：zhxj7410@sina.com。

許多轉基因生物被研發(fā)公司給予不同的商品名稱，以便在市場上進行商業(yè)化運作。然而其遺傳性狀和商品名不一定完全相同，即具有不同商品名稱的轉基因生物可能具有相同的遺傳性狀，以相同商品名稱出售的轉基因生物可能包含不同的遺傳性狀。因此，明確產品含有何種轉基因成分的唯一方法就是通過轉基因生物檢測。

自1996年轉基因作物商業(yè)化以來，轉基因技術研究范圍不斷擴大，全球轉基因作物種植面積持續(xù)增加。2017年，全球轉基因作物種植面積達到1.898億hm2，轉基因作物在帶來巨大經濟效益和生態(tài)效益的同時，其潛在風險也一直飽受爭議，因此建立快速且準確地轉基因檢測體系十分重要[1]。

國際上批準商業(yè)化種植的轉基因作物經過了最為嚴格的安全評價與檢測，也建立了有史以來最為嚴格的監(jiān)管體系[2]。我國同樣十分重視農業(yè)轉基因生物安全管理工作，每年都會組織開展農業(yè)轉基因生物安全監(jiān)管工作，一些相關的檢測手段也正在不斷地完善中。從2002年起，農業(yè)部發(fā)布了一系列農業(yè)轉基因生物安全標準，截至2017年12月，現(xiàn)行有效的標準共176項，其中，產品成分檢測類的標準有100項[3]。作為法規(guī)實施的重要技術保障，農業(yè)轉基因標準在安全評價、安全監(jiān)管、檢測監(jiān)測和產品標識等方面發(fā)揮了重要作用。轉基因作物管理的完善，需要快速而簡便的檢測方法。

一方面轉基因作物種植面積逐年上升，品系（事件）越來越多、元件構成越來越復雜，另一方面轉基因作物對人和環(huán)境的安全性問題也備受爭議，同時轉基因作物非法種植、流通及低水平混雜現(xiàn)象時有發(fā)生。因此許多國家都制定了相應的定性定量檢測和標識制度。我國嚴格按照法律法規(guī)開展轉基因安全評價和安全管理，只有通過安全評價后，方可獲得生產應用安全證書。然而目前監(jiān)管實踐中卻依然缺乏對轉基因成分進行高通量、快速高效、操作簡單、低成本的檢測技術與配套產品。

1轉基因作物檢測技術研究進展

1.1商業(yè)化轉基因作物的主要外源元件

目前國內外轉基因生物研發(fā)迅猛，各種新型的轉化體層出不窮，給轉基因檢測工作帶來極大挑戰(zhàn)?，F(xiàn)國內外商業(yè)化轉基因作物主要有玉米、大豆、棉花、水稻、油菜，這5類主要轉基因作物的外源插入基因序列按啟動子、終止子、目的基因、標記基因進行分類統(tǒng)計分析，主要檢測元件包括：

轉基因玉米檢測CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、bar、pat、Cp4-epsps、m-epsps、Cry1Ab、nptII、CaMV 35S終止子、NOS終止子等;

轉基因大豆檢測CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、pat、Cry1Ac、Cp4-epsps、NOS終止子、E9終止子等;

轉基因棉花檢測CaMV 35S啟動子、FMV 35S啟動子、pat、Cry1Ab/Ac、Cp4-epsps、API、CpTI、nptII、NOS終止子、E9終止子等;

轉基因水稻檢測CaMV 35S啟動子、bar、Cry1Ab/Ac、nptII、hpt、NOS終止子等;

轉基因油菜檢測CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS啟動子、bar、pat、Cp4-epsps、NOS終止子、E9終止子等。

各類檢測元件可在轉基因檢測相關數(shù)據(jù)庫中查詢，數(shù)據(jù)庫主要有GMDD（GMO Detection Method Database）、EU Database of Reference Methods for GMO Analysis、GMO Compass。

1.2轉基因作物的檢測方法概述

根據(jù)檢測轉基因作物中的目標物，轉基因作物的成分檢測主要從3個方面入手：（1）針對基因核酸的檢測，在檢測的特異性上，又分為篩選檢測、基因特異性檢測、構建特異性檢測、轉化體特異性檢測等類型，利用的方法主要為定性PCR和實時熒光定量PCR 2種;（2）針對蛋白質的檢測，主要包括蛋白質印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法;（3）基于代謝物的檢測，主要包括高效液相色譜法和雙向電泳法[4-8]。

目前，檢測中最常用的仍是定性PCR和實時熒光PCR方法[7]。與此同時，雖然許多國家已經實施了嚴格的轉基因標識管理規(guī)定，但經常有未經授權和不受控制的轉基因作物被釋放的報道，因此迫切需要一種即時、敏感、簡單、低成本、易于操作的方法來進行現(xiàn)場檢測轉基因作物[9]。

轉基因快速檢測技術在政府監(jiān)管、企業(yè)內控等方面發(fā)揮的作用越來越重要。農業(yè)農村部曾在印發(fā)的農業(yè)轉基因生物安全監(jiān)管工作方案中建議，充分利用試紙條等快速檢測方法，降低成本，擴大監(jiān)測范圍[10]。

2轉基因作物的快速檢測技術研究進展

轉基因作物常規(guī)檢測法結果比較可靠，但樣品前處理繁瑣、檢測成本高、時間長，需要專門的技術人員，無法滿足快速、低成本等實際的需要，從而催生出許多的快速檢測技術，如各種試紙條、生物芯片、傳感器等，這些技術的加入為現(xiàn)場檢測提供了更廣闊的發(fā)展空間。其中，目前實際應用比較多的是以PCR為基礎的檢測方法和以DNA雜交為基礎的生物傳感器[11]。

2.1以核酸恒溫擴增為基礎的快速檢測

核酸恒溫擴增技術與常規(guī)PCR相比，可在恒定溫度下使DNA或者RNA目標片段延伸，對儀器要求較低，通常簡易的水浴鍋或恒溫槽等就可以滿足要求，擺脫了傳統(tǒng)擴增方法對精密溫控設備的需求，實現(xiàn)快速檢測，大致可分為4類：（1）鏈置換DNA聚合酶介導的反應，如環(huán)介導恒溫擴增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）、交叉引物恒溫擴增（cross-priming amplification，CPA）和滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）;（2）酶促解旋/引物退火的反應，如重組酶介導擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）;（3）基于RNA轉錄的擴增反應，如轉錄介導的擴增（transcription-mediated amplification，TMA）和基于核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）;（4）基于單鏈剪切輔助的反應，如鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）和切口酶介導的擴增（niking enzyme amplification reaction，NEAR）[12]。其中，以LAMP、CPA、RPA等簡便快速的恒溫擴增技術在轉基因檢測中已受到廣泛關注。

2.1.1基于LAMP技術的快速檢測方法

LAMP技術依賴于能識別靶標序列上6個特異區(qū)域的4條引物（包括正向外引物、正向內引物、反向外引物和反向內引物）和1個具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下特異、高效、快速地擴增靶基因，靈敏度高、特異性高。另外，通過設計2條環(huán)引物（正向環(huán)引物和反向環(huán)引物）可加快LAMP反應速度，使整個反應時間縮短[13-15]。與CPA不同的是，LAMP擴增具有更高的擴増效率，更大的產物生成量，常用的是濁度法、鈣黃綠素法和SYBR Green Ⅰ熒光法[16]。LAMP擴增以其高特異性和高擴增效率的特點在食品、環(huán)境、農業(yè)、臨床等多個方面都有廣泛的應用。Shao等發(fā)展了基于毛細管陣列的恒溫核酸擴增技術（capillary array-based loop-mediated isothermal amplification for multiplex visual detection of nucleic acids，CALM），該平臺可實現(xiàn)并行的多重LAMP反應，研究人員選取了7種常用且重要的轉基因元件（P-CaMV35S、bar、cp4-epsps、P-FMV 35S、pat、T-nos、nptII），同時加入5個物種內源基因（ADH1、Sad1、SPS、HMG I/Y、Lectin）作為陽性對照對平臺進行性能測試，表明CALM技術平臺具有極高的檢測準確性，也表明其在實際檢測領域有著很好的運用前景[17]。Wang等研究引入了一種新型的金屬指示劑-酸性絡藍K（acid chrome blue K，ACBK），建立了閉管LAMP擴增和檢測結果可視化檢測技術，并以T-nos和P-CaMV35S為靶序列，建立了TNOS-ACBK-LAMP和P35S-ACBK-LAMP檢測體系，檢測結果既可以裸眼直接判斷也可以借助紫外可見光譜分析[18-19]。為了使診斷技術更加簡便易行，使之適用于在田間操作，Wang等建立了轉基因作物葉片DNA快速提取技術，并使用普通保溫杯為LAMP反應提供所需的恒溫條件，通過肉眼判別是否產生焦磷酸鎂白色沉淀來檢測轉基因作物，最終研發(fā)出一套不依賴電源不依賴實驗室條件、可以在30 min內完成的田間LAMP檢測技術體系[20]。

2.1.2基于CPA技術的快速檢測方法

CPA主要利用具有鏈置換功能的DNA聚合酶結合特殊的引物設計在體外恒溫條件下（63 ℃）特異、高效、快速地復制模板完成擴增，并通過側橫流試紙條進行檢測[21]?？焖?、簡單、不需要昂貴儀器和分子實驗室的特點使CPA逐漸受到關注，Huang等利用CPA結合側橫流試紙條用來對轉基因產品進行現(xiàn)場篩選，通過檢測CaMV35S基因可檢測0.05%的轉基因玉米MON810[22]。

2.1.3基于RPA技術的快速檢測方法

重組聚合酶擴增（RPA）技術被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA擴增的速度非常快，靈敏度高，對硬件設備要求低，而且不需要復雜的樣本處理。這樣的技術特別適合于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物防御、農業(yè)等領域。RPA能在室溫條件（37～42 ℃）下快速檢測樣本里的痕量DNA。Xu等用這一技術在15～25 min內檢出了只含100拷貝目標分子的樣本。此外，他們還建立了實時RPA分析體系，成功檢測了4種主要的轉基因作物（玉米、水稻、棉花和大豆）[23]。Wang等研發(fā)了一種靠人體加熱介導的RPA方法，試驗結果可通過肉眼直接觀察，結果表明該方法可在不同的環(huán)境溫度下準確檢測耐除草劑轉基因大豆GTS 40-3-2[9]。

2.2以DNA雜交為基礎的快速檢測

貴金屬納米粒子（金、銀、銅等）具有強烈的光-物質相互作用特性。納米結構材料與表面價電子集體振蕩頻率匹配的光子相互作用時會發(fā)生局域表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）現(xiàn)象。該方法具有樣品處理方法簡化、高通量、特異性強等特征，可以免除基因檢測中復雜的PCR擴增環(huán)節(jié)。Jang等展示了金納米粒子LSPR效應可用于檢測耐除草劑大豆外源基因，經過30 min雜交反應后，在540 nm條件下可最低檢測含1 nmol/L目標DNA的樣品[24]。程志強等利用表面等離子共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRi）技術，分析了玉米的6種轉基因序列和6種轉基因操作元件，并證明可將DNA和RNA探針結合的信號放大40倍左右[25]。

Yun等研制出自動微流控薄膜芯片（auto-microfluidic thin-film chip，AMTC）來多重檢測轉基因玉米，將DNA探針固定于方形尼龍薄膜上并置于反向斑點雜交儀器的反應室內，該方法檢測極限可達到0.1%，表明膜芯片技術的檢出限不低于普通PCR和實時熒光定量PCR[26]。

2.3以蛋白質為基礎的快速檢測

基于抗體識別轉基因蛋白的快速檢測一直是國內外快速檢測領域應用最為廣泛的方法，農業(yè)部曾明文推薦該方法用于轉基因生物安全監(jiān)管實踐[10]。Freitas等研制出阻抗型電化學免疫傳感器用于檢測轉基因玉米種子中表達的Cry1Ab蛋白，該方法可檢測轉基因玉米種子質量分數(shù)含量為0～5%的樣品，整個分析過程約需4 h，且與ELISA分析具有相同的精確度，為在田間簡便快速地檢測轉基因作物的殺蟲蛋白提供了廣闊的應用前景[27]。Gao等研制了一種基于碳納米團簇的無標記電化學發(fā)光免疫傳感用于檢測Cry1Ab蛋白，該方法可在65 min內檢出含3 pg/mL Cry1Ab蛋白的樣品，另外，該方法還分別成功檢出了含0.10%轉基因水稻BT63的樣品和含0.02%轉基因玉米MON810的樣品[28]。

磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNps）已運用于提取轉基因大豆基因組DNA，實現(xiàn)了樣品的快速高效提取[29]。Liang等又成功將該技術運用于Cry1Ac蛋白的檢測，該技術具有更高的靈敏度，可檢測0.1 pg/L～1.0 mg/L含量的Cry1Ac蛋白[30]。

2.4其他快速檢測技術

拉曼光譜（raman spectroscopy，RS）是一種散射光譜，具有檢測過程簡單、檢測效率高、不會造成環(huán)境污染、大大降低檢測成本等特點[31-32]。林萍等發(fā)明了一種轉基因水稻種子及其親本的快速檢測方法，采用拉曼光譜裝置獲取轉基因水稻種子及其親本的拉曼光譜散射特征曲線，采用核主成分分析法獲取核主成分，將核主成分作為大間隔最近鄰居算法的輸入變量，在核空間中實現(xiàn)轉基因水稻種子樣本的鑒定[33]。Kadam等利用表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術，研發(fā)出省去PCR擴增，且可高靈敏精確檢測出含有0.1 pg轉基因擬南芥的樣品[11]。

3轉基因檢測討論及展望

3.1快速檢測方法存在的問題

使用核酸恒溫擴增技術已能在較短的時間內、恒定的溫度下對核酸完成擴增，不需要精密的溫控設備，具備易于集成的潛力，為便攜核酸分析提供了基礎，但在實際應用中仍然存在一些不足。大部分恒溫擴增檢測方法自身存在一定程度的缺陷。試紙條法：盡管核酸試紙條法價格低廉、使用方便、特異性強，但具有需要開蓋檢測的弊端，使得研究者不得不借助其他手段避免氣溶膠的產生。濁度法：盡管濁度法檢測核酸擴增非常直觀，但很多情況下難以用肉眼分辨結果，容易造成誤判。因此，目前盡管快速檢測方法層出不窮，考慮到檢測結果的穩(wěn)定性，全世界范圍內轉基因檢測中最常用的仍是定性PCR和實時熒光PCR方法[7]。

3.2快速檢測技術在監(jiān)管中的應用前景

從檢測原理考慮，以傳統(tǒng)核酸擴增為基礎的轉基因檢測技術面臨兩大主要的關鍵挑戰(zhàn)，即特異性檢測引物設計及高質量模板DNA的獲取。目前，隨著加工技術水平和加工精度的提高，原料DNA在加工過程中破壞更為嚴重。同時，精細化的加工過程往往容易引入更多物理、化學或生物性的PCR抑制因子，造成了模板DNA質量的降低，客觀上又給轉基因檢測帶來了困難。因此，為提高轉基因成分檢測的特異性及靈敏度，需大力發(fā)展復雜樣品（如深加工食品樣品、干擾成分復雜樣品等）的核酸提取和純化技術，同時也應發(fā)展特異性和靈敏度更高、重復性更好、檢測更快速、結果更可靠的新型核酸檢測技術，同時需依據(jù)相應的技術特點對不同檢測技術進行組合使用，形成行之有效的檢測技術。可以預見，隨著各種商業(yè)化轉基因產品種類和數(shù)量加速推出，必然要求在短時間內同時完成大量樣品的各種轉基因成分檢測，因此，高通量、自動化、微型化、低成本、高靈敏度、高特異性、快速簡便、準確高效的轉基因檢測技術及技術組合將是未來轉基因檢測技術研究與應用的發(fā)展方向。

3.3新型生物技術植物的安全管理

隨著轉基因技術更加精準，基因編輯技術、定點重組技術的突破有望使基因操作實現(xiàn)安全化、精準化，同時也面臨如何對這個新生事物進行監(jiān)管和檢測的新問題。

一方面，隨著轉基因研究的深入與發(fā)展，如以CRISPR/CAS9為代表的基因組定點編輯技術，在轉基因研發(fā)中得以應用與發(fā)展，轉基因產品呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展的趨勢。為維護自己的商業(yè)利益，研發(fā)單位往往不愿將相應的遺傳改造信息，特別是基因序列信息對外公布，造成遺傳改造的基因序列信息難以獲取。此類基因編輯作物不同于傳統(tǒng)轉基因作物，基因編輯作物更多的是對目的基因的刪除、插入、堿基突變等，這些基因編輯作物在基因水平上可能與傳統(tǒng)育種相比無明顯差異，這增加了檢測的復雜性。如何有效區(qū)分基因編輯作物與自然突變作物仍然是檢測的一大難點。

另一方面，對于傳統(tǒng)轉基因作物的檢測技術來說，基于蛋白質的檢測技術是其重要的組成部分。但是對于RNAi轉基因作物（比如轉基因番木瓜）來說，由于沒有外源蛋白的表達，基于蛋白質的轉基因檢測技術就不再適用。這對RNAi轉基因作物的現(xiàn)場快速檢測提出了更高的要求。因此，開發(fā)新型的可以對RNAi轉基因成分進行現(xiàn)場檢測的快速檢測方法是未來RNAi轉基因作物監(jiān)管的基礎。

為精確地對轉基因產品中的轉基因成分進行定量，研究人員須研發(fā)出更多更好的適合轉基因作物檢測需求的方法和快速篩查技術。

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