2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸酶法合成工藝優(yōu)化

黃立萍 郝建華 王 偉 孫晶晶 劉均忠

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，山東 青島 266071；2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；3. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005)

摘要：以L-抗壞血酸和β-環(huán)糊精為底物，利用海洋微生物Y112所產(chǎn)的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)催化合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)。在單因素試驗的基礎上應用Plackett-Burman試驗設計篩選出3個對AA-2G產(chǎn)量有顯著影響的因素(pH、底物濃度、加酶量)，然后應用Box-Behnken方法進行三因素三水平的試驗設計優(yōu)化AA-2G酶法合成工藝。結果表明，最佳工藝條件為：加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉化時間24 h，溫度45 ℃。該條件下，AA-2G的產(chǎn)量為10.62 g/L。

關鍵詞：L-抗壞血酸；2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸；環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶；海洋微生物

基金項目：國家重點研發(fā)計劃(編號：2018YFC0311106)；青島海洋科學與技術試點國家實驗室-鰲山科技計劃(編號：2016ASKJ14)；青島市市南區(qū)科技發(fā)展計劃(編號：2018-4-002-ZH)

作者簡介：黃立萍，女，上海海洋大學在讀碩士研究生。

通信作者：郝建華(1976—)，男，黃海水產(chǎn)研究所研究員，博士。

E-mail:haojh@ysfri.ac.cn

收稿日期：2018-02-09

DOI：10.13652/j.issn.1003-5788.2018.11.037

Abstract： 2-O-α-D-glucopyranosylL-ascorbic acid(AA-2G) was transformed by marine microorganism cyclodextrin glucanotrans-ferase (CGTase) usingL-ascorbic acid andβ-cyclodextrin(β-CD) as substrate. The qualitative and quantitative analyses of AA-2G were undertaken by LC-MS and HPLC. On the basis of single factor experiment Plackett-Burman design was carried out to determine three main effective factors (pH, substrate concentration, enzyme concentration). Then Box-Behnken design using three factors and three levels was applied to optimize synthesis conditions of AA-2G. The results indicated that the optimum conditions were pH 9.07, enzyme concentration 90.78 U/g·β-CD, substrate concentration 56.81 g/L, the ratio of substrate 1∶1(volume ratio), reacting for 24 h, at 45 ℃. Under this condition the yield of AA-2G was 10.62 g/L.

Keywords：L-ascorbic acid; 2-O-α-D-glucopyranosylL-ascorbic acid; cyclodextrin glucanotransferase; marine microorganism

L-抗壞血酸(L-ascorbic acid，L-AA)又名VC，是一種人體不可缺少的營養(yǎng)素，人體自身無法合成VC，必須從食物中獲得。VC在多種生理活動中均起到重要作用，如膠原蛋白合成、改善脂肪代謝、提高免疫力等[1]。VC可廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)療等行業(yè)[2-4]，然而VC分子結構中具有特殊的連烯二醇結構，容易被氧化失去生理活性，限制了它在各領域中的應用[5]。因此，人們一直致力于開發(fā)穩(wěn)定性好的VC衍生物。

2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)是一種VC糖苷類衍生物，被認為是VC的最佳替代品，具有穩(wěn)定性好、安全性高、生理活性與VC最接近等優(yōu)勢。由于AA-2G進入人體后可被緩慢分解成VC與D-葡萄糖，能持續(xù)提供VC[6]，因此可添加到食品中作為抗氧化劑、VC補充劑等。此外還可應用于醫(yī)療保健、化妝品、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域[7]。

AA-2G主要通過酶法合成，即利用環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)的轉糖基作用，將葡萄糖基以α-1,4糖苷鍵接于L-抗壞血酸的C2上，取代原有的羥基。近年來中國對AA-2G的合成已有很多研究報道，高愛偉等[8]利用CGTase、麥芽糊精和VC合成AA-2G，在最優(yōu)條件下產(chǎn)量為3.13 g/L；Eibaid等[9]利用CGTase轉化合成AA-2G，最高產(chǎn)量為7.05 g/L；單麗媛[10]用游離CGTase合成AA-2G，經(jīng)條件優(yōu)化后產(chǎn)量為6.02 g/L。但均未達到工業(yè)化生產(chǎn)水平，一方面是由于底物的轉化率較低，另一方面是單位酶活低，導致生產(chǎn)成本高。

海洋中有著極為豐富的微生物資源，隨著海洋資源的進一步開發(fā)，與海洋微生物酶相關的研究逐漸增多，海洋微生物已成為開發(fā)新型酶制劑的重要來源。目前來自深海和極地的極端微生物作為產(chǎn)酶資源也成為研究熱點，低溫酶、堿性酶和耐鹽酶等結構和功能新穎的極端酶以其獨特的催化作用大大拓寬了微生物酶的應用范圍。但是，目前報道的從海洋環(huán)境中分離的產(chǎn)CGTase的菌株只有本課題組所篩選到的Y112菌株[11]，該菌株所產(chǎn)的酶穩(wěn)定性好，單位酶活較高，在轉化淀粉制備α-環(huán)糊精方面有一定的優(yōu)勢[12]，未見其他海洋來源的產(chǎn)CGTase菌株。因此本研究繼續(xù)探討其在海洋生物酶法合成AA-2G方面的應用潛力，以VC和β-環(huán)糊精(β-CD)為底物，采用單因素試驗和響應面分析法對合成條件進行優(yōu)化，以期提高AA-2G的產(chǎn)量，為今后的合成工藝研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

AA-2G標準品：色譜純，美國Sigma公司；

VC標準品：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

海洋微生物環(huán)糊精葡萄糖苷轉移酶酶粉：電泳純，酶活力80 U/g，本研究室發(fā)酵制備；

β-環(huán)糊精、VC：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

磷酸；色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；

甲醇：色譜純，德國默克醫(yī)藥生物科技公司；

甲酸：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

全溫搖床：Modle 481型，美國賽默飛世爾科技公司；

臺式高速離心機：H1650-W型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

電子天平：HANGPING FA1004型，上海精密科學儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國戴安公司；

高分辨質譜儀：maXis Q-TOF型，美國布魯克·道爾頓公司；

色譜柱：Symmetry C18型，5 μm (2.1 mm×150 mm)，美國沃特世科技有限公司；

高效液相色譜儀：2695型，美國沃特世科技有限公司；

檢測器：2996型，美國沃特世科技有限公司；

色譜柱：SB-Aq型，5 μm(250 mm×4.6 mm)，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶酶活測定方法

(1) 試驗組：用0.2 mol/L的NaOH-甘氨酸緩沖液(pH 8.5)配制4 g/100 mL可溶性淀粉液做為底物，取0.9 mL 底物于試管中，50 ℃水浴預熱5 min，然后加入適當稀釋倍數(shù)的酶液0.1 mL混合均勻，50 ℃水浴準確反應10 min，再加入1 mL鹽酸溶液(1 mol/L)終止反應，最后加入4 mL甲基橙溶液(8 mg/L)混勻，室溫靜置20 min。

(2) 對照組：取底物0.9 mL于試管中，50 ℃水浴預熱5 min。隨試驗組一起50 ℃水浴反應10 min，加入1 mL鹽酸溶液混合均勻后，再加入與試驗組相同的酶液，其他處理與試驗組相同。最后用紫外分光光度計在507 nm下測定試驗組與對照組的吸光度。1個酶活力單位定義為上述條件下1 min 生成1 μmolα-環(huán)糊精所需要的酶量[13]。

1.2.2 AA-2G的鑒定 通過LC-MS 檢測轉化產(chǎn)物中是否含有AA-2G，檢測條件：柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，流動相為95%的甲酸(濃度為2%)和5%的乙腈，離子方式ESI+，錐孔電壓4.5 kV，碰撞能量8 eV，質量范圍50～1 500m/z。

1.2.3 AA-2G含量測定 根據(jù)文獻[14]，修改如下，HPLC條件為：檢測波長254 nm，流動相20 mmol/L稀磷酸，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。用超純水配制濃度為：250，500，1 000，1 500，2 000，3 000 mg/L的AA-2G標準液，通過HPLC分析，以AA-2G濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，利用軟件Empower pro制作AA-2G的標準曲線。經(jīng)HPLC分析得出反應液中AA-2G峰面積后，在軟件Empower pro中處理可直接得出AA-2G濃度。

1.2.4 單因素試驗設計 酶法轉化合成AA-2G條件中主要包括轉化時間、溫度、pH、底物濃度、底物配比、加酶量6個關鍵因素。設計單因素試驗考察這6個因素對酶法合成AA-2G產(chǎn)量的影響，所有試驗均重復3次。初始轉化條件：反應總體系為2 mL，配制濃度均為100 g/L的β-環(huán)糊精溶液和VC溶液，各取1 mL加入反應容器中作為底物(終濃度均為50 g/L)，以及0.2 g Na2SO3作為抗氧化劑，調節(jié)pH至9，按照100 U/g·β-環(huán)糊精的比例加入CGTase，在35 ℃，150 r/min反應24 h。

(1) 轉化時間：按照初始轉化條件，其他條件不變，轉化時間分別設為6，12，18，24，36，42，48 h進行反應。

(2) 溫度：按照初始轉化條件，其他條件不變，反應溫度分別設為15，25，30，35，40，45，50，55 ℃進行反應。

(3) pH值：按照初始轉化條件，其他條件不變，調節(jié)pH值分別至4，5，6，7，8，9，10，11進行反應。

(4) 底物濃度：按照初始轉化條件，其他條件不變，β-環(huán)糊精溶液和VC溶液的終濃度相同，均分別設置為10，20，30，40，50 g/L。

(5) 底物配比：按照初始轉化條件，其他條件不變，分別設置β-環(huán)糊精溶液與VC溶液的比例(體積比)為1∶4，2∶3，1∶1，3∶2，4∶1作為底物進行反應。

(6) 加酶量：按照初始轉化條件，分別按照0，50，100，150，200，250，300 U/g·β-環(huán)糊精的比例加入CGTase進行反應。

1.2.5 Plackett-Burman試驗設計 在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗對轉化時間、溫度、pH、底物濃度、底物配比、加酶量6個因素進行篩選，從中選出對酶法合成AA-2G具有顯著影響的因素，采Design-Expert.8.0.6軟件進行試驗設計及結果分析，每組試驗均重復3次。

1.2.6 Box-Behnken試驗設計 根據(jù)Plackett-Burman篩選出的3個顯著影響因素，每個因素取3個水平，進行三因素三水平的試驗，所有試驗均重復3次，以獲得酶法轉化合成AA-2G的最佳工藝條件。

2 結果與討論

2.1 LC-MS鑒定轉化液中AA-2G

為了確認反應液中是否有AA-2G生成，對AA-2G標準品和反應液進行質譜鑒定。AA-2G的分子量為338.27。AA-2G標準品[圖1(a)]m/z=339(M+H+)=m/z361(M+Na+)，反應液[圖1(b)]m/z= 361.07 (M+Na+)，推斷其分子量為338.07，與標準樣品MS圖一致，由此可說明反應液中含有 AA-2G。

圖1 AA-2G標準品及反應液MS圖

2.2 HPLC檢測反應液中AA-2G含量

通過HPLC檢測分析AA-2G標準品、VC標準品和反應液，結果表明，VC標準品的保留時間是5.08 min[圖2(b)]，AA-2G標準品保留時間是5.6 min[圖2(a)]，與反應液在5.6 min 處出現(xiàn)的峰保留時間[圖2(c)]一致。通過HPLC檢測梯度濃度AA-2G標準液，以AA-2G濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，利用軟件Empower pro制作AA-2G標準曲線，方程為Y=7.09E+003X+1.33E+006(R2=0.98)，經(jīng)HPLC分析得出反應液樣品中AA-2G峰面積后，在軟件Empower pro中處理可直接得出其AA-2G濃度。

2.3 酶法轉化合成AA-2G的單因素試驗

2.3.1 轉化時間對酶法合成AA-2G的影響 由圖3可知，隨著轉化時間的延長，AA-2G的產(chǎn)量大幅度增加，當時間達到24 h時，AA-2G的產(chǎn)量最高，超過24 h后，AA-2G產(chǎn)量開始減少，可能是隨反應時間的延長有其他VC衍生物生成。所以選擇24 h進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化進行研究。

圖2 AA-2G標準品、VC標準品及反應液HPLC圖

Figure 2 HPLC analysis of AA-2G standard sample and VCstandard sample and biotransformation product

圖3 轉化時間對合成AA-2G的影響

2.3.2 溫度對酶法合成AA-2G的影響 由圖4可知，隨著反應溫度的升高，酶法轉化合成AA-2G的產(chǎn)量也在不斷增加，45 ℃時達到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，AA-2G的產(chǎn)量反而逐漸下降，可能是β-環(huán)糊精溶解度較小，溫度太低造成β-環(huán)糊精析出，而溫度過高會導致部分酶活損失。所以選擇45 ℃進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.3 pH對酶法合成A A-2G的影響 由圖5可知，當pH達到9時，酶法轉化合成AA-2G的產(chǎn)量最高，為8.03 g/L；

圖4 溫度對合成AA-2G的影響

圖5 pH對合成AA-2G的影響

當pH再升高時，AA-2G的產(chǎn)量反而下降，可能是本實驗室制備的CGTase最適pH為堿性，pH太低造成酶失活，而pH過高使VC氧化速度加快，因此合成AA-2G的產(chǎn)量下降。所以選擇pH 9進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.4 底物濃度對酶法合成AA-2G的影響 由圖6可知，隨著底物濃度的不斷增加，AA-2G的產(chǎn)量也隨之增加。當?shù)孜餄舛冗_到50 g/L時，AA-2G的產(chǎn)量達到最高(6.6 g/L)。當?shù)孜餄舛瘸^50 g/L時，AA-2G的產(chǎn)量反而略有下降，可能是高濃度底物降低了水的有效濃度，降低了分子擴散性，從而降低了酶促反應速度。所以選擇底物濃度為50 g/L進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.3.5 底物配比對酶法合成AA-2G的影響 由圖7可知，當β-環(huán)糊精溶液的比例逐漸增大時，AA-2G產(chǎn)量緩慢增加，當β-環(huán)糊精溶液與VC溶液體積比達到1∶1時，AA-2G的產(chǎn)量最大，可能由于β-環(huán)糊精是糖基供體的提供者，其所占比例過大使得小分子糖類副產(chǎn)物生成量太多，與 VC競爭CGTase的受體位點從而抑制了AA-2G生成[14]，所占比例過小則糖基供體不足，都不利于AA-2G的合成，所以選擇β-環(huán)糊精溶液與VC溶液的體積比為1∶1進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

圖6 底物濃度對合成AA-2G的影響

圖7 底物配比對合成AA-2G的影響

2.3.6 加酶量對酶法合成AA-2G的影響 由圖8可知，在一定范圍內隨著酶濃度的增高，AA-2G的產(chǎn)量隨之增加。當酶濃度達到100 U/g·β-環(huán)糊精時，AA-2G的產(chǎn)量最高，達到7.6 g/L。酶濃度繼續(xù)升高，AA-2G的產(chǎn)量反而逐漸降低，可能是加酶量過大導致反應過程中過多小分子糖類副產(chǎn)物產(chǎn)生，制約了AA-2G的產(chǎn)量。所以選擇酶濃度為100 U/g·β-環(huán)糊精進行后續(xù)酶法轉化合成AA-2G條件優(yōu)化研究。

2.4 Plackett-Burman試驗

在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗對6個因素進行篩選，每個因素取2水平，PB試驗因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對Plackett-Burman試驗結果進行處理，得到PB試驗結果分析見表3，pH、底物濃度、加酶量3個因素的P值<0.05，是顯著因素，因此確定這3個因素為AA-2G產(chǎn)量的主要影響因子。

2.5 Box-Behnken試驗

Box-Behnken試驗因素水平見表4，試驗設計及結果見表5。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

用Design-Expert V8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，分析結果見表6，P值<0.000 1，說明該模型是顯著的，失擬項P=0.127 3>0.05，表明該模型的失擬項不顯著。方程的R2=0.976 9，說明模型擬合度較好，能較好地預測AA-2G產(chǎn)量變化。二次多項式回歸方程：

Y=10.25-0.99A-0.41B+2.06C-0.90AB+0.74AC+1.60BC-2.18A2-2.02B2-3.01C2。

(1)

2.6 響應面圖分析

用Design-Expert V8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，各因素的交互作用對酶法轉化AA-2G產(chǎn)量的影響見圖9～11。

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果

表4 Box-Behnken試驗因素水平

由圖9可知，響應面變化明顯，隨著pH的升高，AA-2G產(chǎn)量先緩慢增加后減小，隨著加酶量的增大，AA-2G產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。等高線圖表明，等高線呈橢圓形，說明交互作用較強。由表6可知，其交互作用對AA-2G產(chǎn)量影響極顯著。由圖10可知，響應面變化明顯，隨著底物濃度和加酶量的增大，AA-2G產(chǎn)量先增加后減小。等高線圖表明，沿底物濃度軸向的等高線變化密集，加酶量的軸向等高線變化比較稀疏，說明底物濃度對AA-2G產(chǎn)量的影響比加酶量大，等高線呈橢圓形，說明交互作用強，由表6可知，其交互作用對AA-2G產(chǎn)量影響顯著。由圖11可知，響應面變化明顯，隨著底物濃度和pH的增加AA-2G產(chǎn)量先升高再逐漸降低。等高線圖表明，沿底物濃度軸向的等高線變化密集，pH的軸向等高線變化相對稀疏，說明底物濃度對AA-2G產(chǎn)量的影響比pH大，等高線呈橢圓形，說明交互作用強，由表6可知，其交互作用對AA-2G產(chǎn)量影響極顯著。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

表6 響應面模型方差分析表?

? **表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(0.01

2.7 驗證實驗

對回歸方程進行分析，得到理論最優(yōu)條件組合：加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度為56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉化時間24 h，溫度45 ℃，該條件下AA-2G達到最高產(chǎn)量為10.67 g/L。在此條件下進行驗證實驗，3次實驗AA-2G平均產(chǎn)量為10.62 g/L，與模型預測值基本吻合，說明該試驗選用的模型是合理的。

圖9 加酶量與pH對AA-2G產(chǎn)量的交互作用

圖10 加酶量和底物濃度對AA-2G產(chǎn)量的交互作用

圖11 pH和底物濃度對AA-2G產(chǎn)量的交互作用

3 結論

本研究采用單因素試驗設計及響應面分析法對CGTase酶法合成AA-2G的條件進行優(yōu)化，得到了最優(yōu)工藝條件為加酶量90.78 U/g·β-環(huán)糊精，pH 9.07，底物濃度56.81 g/L，底物配比1∶1(體積比)，轉化時間24 h，溫度45 ℃，在此條件下AA-2G產(chǎn)量為10.62 g/L。相較于之前的研究[15]，AA-2G產(chǎn)量達到較高水平。CGTase酶被認為是合成AA-2G的最佳酶源，但該酶價格昂貴，本實驗室利用海洋微生物Y112發(fā)酵制備的CGTase酶粉單位酶活較高，有利于降低生產(chǎn)成本。然而游離酶存在難以回收利用的缺點，后續(xù)將對固定化CGTase合成AA-2G進行研究，進一步提高AA-2G產(chǎn)量及固定化CGTase的利用次數(shù)。