呂丹丹 何 佳 宋文華 袁江月

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

鳳丹(Paeoniaostii‘Feng Dan’) 又名銅陵牡丹，為芍藥科芍藥屬植物，主要產于安徽銅陵，于2006年被中國質檢總局列為“國家地理標志保護產品”[1]。牡丹花具有較高的藥用價值[2]。2013年丹鳳牡丹花被中國衛計委批準為新食品原料[3]。鳳丹作為油用牡丹，各地均有大量種植，生產中為了提高結籽率，需要大量疏花。牡丹花中含豐富的營養物質，包括多酚類物質、蛋白質、可溶性碳水化合物、維生素、多種礦物質等[4]，以及類黃酮類物質，具有良好的抗氧化作用。

目前已有關于乳酸菌發酵對植物酚類物質和抗氧化性影響的報道，如：Cagno等[5]研究發現，混合果蔬汁發酵后，能防止果蔬汁酚類物質的降解，維持了其抗氧化活性；Tabasco等[6]發現，葡萄籽經乳酸菌發酵可增加其沒食子酸的含量；鄭欣等[7]研究發現，腸膜狀明串珠菌相比其他菌發酵后，總酚和色差保留率高。但這些研究都未對發酵后單體酚類物質的變化進行研究。馬利華等[8]研究發現，乳酸菌發酵槐花后，其營養性和抗氧化能力均有所提高；Park等[9]研究發現，植物乳桿菌發酵旋覆花花瓣后，總黃酮含量得到了提高。但這些研究都集中在單種菌發酵后物質的變化。韓雪等[10]發現，植物乳桿菌發酵紅棗漿后，游離態酚含量和抗氧化能力優于其他菌種；Liu等[11]研究也表明，乳酸菌發酵諾麗果汁，可以增強其抗氧化能力。但都未研究發酵后抗氧化與色差間的聯系。目前關于不同乳酸菌發酵對鳳丹花瓣酚類物質、色差和抗氧化能力影響的研究鮮有報道。本試驗擬以鳳丹花瓣為原料，選用8種乳酸菌發酵后，根據總酚、總黃酮含量、色差值和抗氧化能力的變化，篩選出最適的菌種，并采用高效液相色譜法對發酵后單體酚變化進行了分析，以期為研發出一種新型的鳳丹花乳酸菌發酵飲料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鳳丹白花瓣：洛陽洛寧；

檸檬酸：食品級，河南興源化工產品有限公司；

β-環糊精：食品級，江蘇銳陽生物科技有限公司；

果葡糖漿：上海根萊食品有限公司；

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，HZLp-005)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，HZLc-017)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus，HZLh-003)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，HZLb-006)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，HZSt-012)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，HZLr-023)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，HZLa-008)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，HZLp-019)：實驗室保藏；

蘆丁、沒食子酸、芍藥苷、對香豆酸、根皮苷、木犀草素、槲皮素、山萘酚：標準品，上海源葉生物科技有限公司；

福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；

VC：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基：上海藍季生物有限公司；

MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市德恩化學試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市德恩化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2D型，蘇州凈化設備有限公司；

pH計：PHS-25型，上海精密科學儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KB型，上海申安醫療器械廠；

生化培養箱：SPX-250型，北京市永光明醫療儀器公司；

離心機：TG16-W型，河南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

全自動色差計：SC-80C型，北京康光光學儀器有限公司；

高效液相色譜儀：1260型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 分別將8種乳酸菌置于MRS液體培養基中復壯，37 ℃靜置培養18 h。

1.2.2 鳳丹白花瓣浸提液制備 鳳丹花瓣清洗干凈后，切碎(3～5 mm)，加入15倍質量的去離子水打漿，添加護色劑(0.03% 檸檬酸、0.02%β-環糊精)于漿液中，65 ℃水浴1 h。浸提結束后，加入6%果葡糖漿，取100 mL分裝于250 mL三角瓶中，100 ℃滅菌15 min。

1.2.3 鳳丹白花瓣浸提液發酵培養 滅菌后的鳳丹白花瓣浸提液，冷卻，置于無菌操作臺上，分別取 3 mL 乳酸菌發酵劑(菌濃度：8.0～9.0 CFU/mL)，5 000 r/min離心 10 min，棄上清，加入3 mL 滅菌的生理鹽水重懸乳酸菌，接入滅菌的鳳丹花瓣浸提液中，37 ℃靜置培養36 h。發酵液10 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.4 總黃酮含量的測定 亞硝酸鈉—硝酸鋁法[12]。

1.2.5 總酚含量的測定 福林酚試劑法[13]。

1.2.6 色差的測定 參考Rui等[14]的方法采用全自動色差計(透射模式)對發酵鳳丹花浸提液樣品的色澤進行測定。

1.2.7 單體酚含量的測定 參考陳智毅等[15]方法，采用高效液相色譜儀。色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4 mm，5 μm)；流動相A：水，流動相 B：乙腈；洗脫順序：0～25 min，30%～60% B，25～30 min，30% B。柱溫30 ℃；檢測波長230，280，360 nm；流速0.8 mL/min，進樣量10 μL。制作不同濃度的單體酚標準曲線，相關系數均達到0.999以上；標準品回收率為 94%以上，測定重復3次。根據保留時間及峰面積計算樣品中單體酚含量。

1.2.8 鳳丹花乳酸發酵液體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除率的測定：參照文獻[16]；

(2) ABTS自由基清除率的測定：參照文獻[17]；

(3) 還原力的測定：參照文獻[18]。

2 結果與分析

2.1 對總酚和總黃酮的影響

由表1可以看出，與發酵前相比，5種乳酸菌發酵鳳丹花浸提液后，其總酚含量得到了提高，增加幅度為0.20%～4.95%，其中植物乳桿菌發酵后總酚含量顯著增加(P<0.05)，增加量為4.95%。總酚含量增加排序為：植物乳桿菌>嗜酸乳桿菌>保加利亞乳桿菌>干酪乳桿菌>嗜熱鏈球菌。通過8種乳酸菌發酵，發現不同乳酸菌發酵釋放酚的能力不同。李俶等[19]研究發現酚類含量的提高可能是乳酸菌發酵過程中產生了某些酶類，對植物細胞壁進行了水解，進而使細胞中的一些酚類物質釋放出來。植物乳桿菌相比其他菌，發酵后總酚含量顯著提高，可能是其在發酵過程中使更多的糖基化酚類去糖基化，從而使植物細胞壁中可溶性酚釋放[20]。Wouters 等[21]通過復合乳酸菌發酵韭菜，也發現了其游離酚得到了提高。Wu等[22]通過3種不同乳酸菌發酵石蓮花后，發現游離酚含量得到了不同程度的提高，以植物乳桿菌發酵后游離酚含量提高最多。這些與本研究結果一致。

與發酵前相比，6種乳酸菌發酵后總黃酮含量得到了提高，增加幅度為0.64%～12.51%，其中保加利亞乳桿菌和植物乳酸菌發酵后總黃酮含量顯著增加(P<0.05)。植物乳酸菌發酵后黃酮含量提高了12.51%，保加利亞乳桿菌發酵后黃酮含量提高了7.69%。總黃酮增加量按大小排列為：植物乳桿菌>保加利亞乳桿菌>鼠李糖乳桿菌>瑞士乳桿菌>干酪乳桿菌>嗜酸乳桿菌。黃酮含量的提高明顯比總酚含量的顯著，可能是復雜的多酚在發酵過程中被一些酶分解，變成了更簡單的黃酮醇類化合物等[23]。其中植物乳桿菌發酵后，總酚含量和總黃酮含量都顯著提高(P<0.05)。

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 對單體酚的影響

單體酚標準曲線方程見表2。由表3可以看出，鳳丹中蘆丁和槲皮素是含量較多的2種單體酚；而木犀草素、對香豆酸、芍藥苷、根皮苷和山奈酚的含量較低。乳酸菌發酵鳳丹花浸提液后，大部分單體酚含量都有所降低，不同乳酸菌發酵鳳丹花浸提液后單體酚變化也不同。僅保加利亞乳桿菌發酵后蘆丁、槲皮素得到了顯著提高(P<0.05)，其中蘆丁提高了3.16%，槲皮素提高了0.81%。其他7種乳酸菌，植物乳酸菌發酵后蘆丁含量下降最少，為4.84%；嗜酸乳桿菌發酵后槲皮素含量下降最少，為5.47%。

在除了保加利亞乳桿菌外，其他7種乳酸菌發酵后，芍藥苷含量顯著降低(P<0.05)，下降幅度為7.42%～83.20%。對香豆酸在發酵后含量都顯著降低(P<0.05)，下降幅度為9.41%～44.10%。木犀草素的含量，僅瑞士乳桿菌發酵后含量增加，但不顯著，其他下降幅度為4.29%～8.50%。而根皮苷經發酵后含量變化較大，嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌發酵后均未檢測到，植物乳桿菌發酵后含量顯著提高(P<0.01)，增加了78.37%。山奈酚在發酵前未檢測到，經保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵后都有檢測到，其中保加利亞乳桿菌發酵后含量最多。

以上結果表明，乳酸菌發酵對鳳丹花浸提液中的單體酚含量和組成都有影響。其中保加利亞乳桿菌發酵后，蘆丁、槲皮素、芍藥苷和山奈酚含量都有一定的提高；植物乳桿菌發酵后，根皮苷、山奈酚含量提高。Kwaw等[24]用乳酸菌發酵桑葚汁后，蘆丁、槲皮素含量顯著增加。Bisakowski等[25]用植物乳桿菌對紅洋蔥發酵后，能使槲皮素二糖苷降解成槲皮單糖苷。Dueas等[26]研究表明，植物乳桿菌發酵豇豆后，游離態槲皮素含量增加，與本研究相似。研究[27]表明，乳酸菌發酵過程中，產生的多酚氧化酶對高分子量復合酚進行了解聚。pH的降低可以穩定一些酚類[28]，因此在較低pH浸提液中總酚含量高。在較低的pH范圍內，酚類物質的提取量增加[29]。保加利亞乳桿菌產酸能力較弱，發酵液pH值較高，穩定酚類能力較弱，因此發酵后總酚含量沒有植物乳桿菌高，但其單體酚含量多。

表2 單體酚標準曲線方程

表3 不同乳酸菌發酵對鳳丹花浸提液中單體酚的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；ND表示沒有檢測到。

2.3 對色澤的影響

如表4所示，8種乳酸菌發酵對浸提液的亮度影響顯著(P<0.05)，L*值均降低。除植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌外，其他乳酸菌發酵b*值均降低；除鼠李糖乳桿菌外，其他乳酸菌發酵a*值均增加。付磊等[30]研究發現鳳丹白中幾乎不含花青素，故其浸提液顏色淡黃。發酵后浸提液L*值的降低最為顯著的是植物乳桿菌(P<0.05)，而其發酵后總酚、總黃酮最高，說明之間存在關系。如表5所示，L*值與總酚、總黃酮含量顯著負相關(P<0.05)。Lago-Vanzela等[31]研究發現a*值與總酚和總黃酮含量有關，證實了表5中a*值與總酚極顯著相關關系(R2=0.806 5)。b*值與總黃酮含量顯著正相關(R2=0.761 4)，與總酚含量也正相關(R2=0.717 8)，表明總酚、總黃酮含量與b*值也有一定關系。研究[32]表明，當總色差△E>2時，樣品的色澤變化可以通過肉眼觀測，即樣品間的色澤發生了顯著的變化。8種乳酸菌發酵，其中植物乳桿菌△E值變化顯著(P<0.01)，且>2，表明植物乳桿菌發酵后，浸提液顏色變化較大。

表4 不同乳酸菌發酵對鳳丹花浸提液色差的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 總酚、總黃酮與色差的相關系數表?

? “**”表示P<0.01，差異極顯著；“*”表示P<0.05，差異顯著。

2.4 對抗氧化活性的影響

由表6可以看出，鳳丹花浸提液經干酪乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發酵后，DPPH自由基清除率與發酵前相比顯著提高(P<0.01)，增加幅度為4.53%～11.14%。瑞士乳桿菌發酵后清除率增加不顯著，增加了1.25%。DPPH在溶液中可以形成一個穩定的含氮自由基，抗氧化劑等加入后，通過傳遞電子或質子而生成穩定的分子狀態DPPH2，乳酸菌發酵可能會生成一些含有遞質子能力的化合物，從而使清除率升高[33]。由表7可知，DPPH自由基清除率與總酚、總黃酮含量呈正相關關系(R2分別為0.992，0.797)。 與發酵前相比，干酪乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發酵后，ABTS自由基清除率都得到了提高，增加幅度為2.47%～6.58%，僅植物乳桿菌發酵后清除率得到了顯著提高(P<0.05)，為6.58%。ABTS自由基清除率與總酚、總黃酮含量也呈正相關關系(R2分別為0.831 4，0.836 9)。

植物乳桿菌發酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力分別增加了11.14%，6.58%，16.19%；保加利亞乳桿菌發酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力分別增加了4.53%，2.47%，6.07%。這些與2種菌發酵后總酚、總黃酮含量高是一致的。

酚類化合物抗氧化能力的不同可能是其芳香環上所帶羥基數量的不同引起的，因此根據溶液中所含酚類化合物種類和含量的差異，抗氧化活性也可能不同[34]。這些也都證實了，DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力與總酚、總黃酮之間的高相關性關系。從單體酚含量分析，僅保加利亞乳桿菌發酵后，蘆丁和槲皮素含量增加，而植物乳桿菌發酵后下降量也是最少的，這與2種菌發酵后高抗氧化能力存在一定聯系。Bisakowski等[25]用植物乳桿菌對紅洋蔥發酵后，槲皮素二糖苷下降，而槲皮單糖苷增加，后者具有比前者更高的抗氧化活性。由此可見，乳酸菌發酵導致酚類物質間的相互轉化，能明顯改變其抗氧化性。

表6不同乳酸菌發酵前后的抗氧化性與VC的抗氧化性的比較?

Table 6 Comparison of anti-oxidation and anti-oxidation of VCbefore and after fermentation of different lactic acid bacteria

菌種DPPH/%ABTS/%還原力(OD值)發酵前80.23±0.45cd56.05±1.20bc0.247±0.04f干酪乳桿菌88.23±1.00a57.43±1.57b0.267±0.04c嗜熱鏈球菌76.56±0.67e54.47±0.46de0.252±0.05ef保加利亞乳桿菌83.86±0.47b57.05±0.79b0.262±0.04cd植物乳桿菌89.16±0.47a59.71±0.66a0.287±0.03a鼠李糖乳桿菌79.76±0.61d55.43±0.65dce0.250±0.04f瑞士乳桿菌81.23±0.31c54.04±0.59e0.259±0.03de嗜酸乳桿菌79.33±1.08d55.95±1.43bcd0.278±0.05b副干酪乳桿菌77.40±0.46e51.62±0.57f0.233±0.05gVC54.06±0.40f43.10±0.35g0.206±0.04h

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7抗氧化活性與總酚、總黃酮的相關系數表?

Table 7 The correlation coefficient of antioxidant activity and total phenol, total flavonoids difference

項目DPPHABTS還原力總酚總黃酮DPPH1.000 0 ABTS0.832 4??1.000 0 還原力0.689 7?0.823 3??1.000 0 總酚0.992 0??0.831 4??0.887 6??1.000 0 總黃酮0.797 0??0.836 9??0.724 3?0.776 5??1.000 0

? “**”表示P<0.01，差異極顯著；“*”表示P<0.05，差異顯著。

3 結論

本研究結果表明，8種乳酸菌發酵鳳丹花瓣浸提液，部分乳酸菌能夠增加其總酚、總黃酮含量，提高抗氧化能力。其中植物乳桿菌發酵后總酚和總黃酮的含量最高，與對照組相比分別提高了4.95%和12.51%(P<0.05)。蘆丁和槲皮素是鳳丹花瓣浸提液中主要的單體酚，保加利亞乳桿菌發酵后分別提高了3.16%和0.81%(P<0.05)。植物乳桿菌發酵后，DPPH自由基清除率增加了11.14%(P<0.01)，ABTS自由基清除率增加了6.58%(P<0.05)，還原力增加了16.19%(P<0.05)，其抗氧化能力是8種乳酸菌中最強的。植物乳桿菌發酵后，總色差△E>2，發酵液顏色較深，而保加利亞乳桿菌相對較好。因此，后期將采用植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌來發酵鳳丹花瓣。2種乳酸菌均能一定程度提高總酚、總黃酮含量，保加利亞乳桿菌對單體酚的組成和含量影響大，而植物乳桿菌發酵后抗氧化能力最強，故這2種乳酸菌發酵鳳丹花瓣可提升其生理功能。