荔枝皮黃酮微波—雙水相提取工藝優化及DPPH·清除活性

王維力 明 李 阮尚全,2 汪建紅,2

(1. 內江師范學院化學化工學院，四川 內江 641199；2. 四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川 內江 641199)

中國荔枝種植主要分布在兩廣、福建、海南、四川、臺灣等地區，在食用、尤其是生產加工中產生的果皮以丟棄為主，四川合江縣栽植面積已超過2.0×104hm2，年產量達2.0×107kg，果皮按16%計算[1]1，可達到3.20×106kg，其深度利用意義重大。荔枝皮中黃酮含量高達17.92%[2]，在醫藥、食品、化妝品等行業具有極大開發前景[3-4]。目前荔枝皮黃酮提取方法有直接水浴加熱法[1]40-41、超聲波提取法[5]、微波與超聲波耦合[6]、酶法與超聲波耦合[7]等，鮮見用雙水相技術提取的研究報道。微波能顯著縮短提取時間，提高產率，文獻[8～9]用微波法和超聲波法提取同一榴蓮皮中的黃酮，微波法將提取時間由50 min縮短到120 s，產率由3.26%提高到4.84%。雙水相體系因條件溫和、溶劑易回收、易于連續化操作等優點，廣泛應用于生物、食品、制藥等領域，已有工業化應用報道[10-13]。

本試驗擬以四川合江縣荔枝皮為材料，微波和雙水相技術的優點相結合，用響應曲面優化建立提取其中黃酮的理論模型和試驗方法，獲得各因素與響應值之間的函數關系，得到因素的最佳組合，并對提取物清除DPPH·進行了試驗，以期為合江荔枝皮的深度利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫外可見分光光度計：T6-新世紀型，北京普析通用儀器有限公司；

離心機：TD-5型，四川蜀科儀器有限公司；

微波紫外超聲波三位一體合成萃取儀：UWave-1000型，上海新儀微波化學科技有限公司；

中藥粉碎機：DFT-10型，溫嶺市林大機械有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子分析天平：AE240型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

蘆丁、抗壞血酸、二苯代苦味?；诫?DPPH·)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀等：分析純，成都金山化學試劑廠；

試驗用水為蒸餾水；

荔枝皮:采自于四川合江縣荔枝生產基地，果皮低溫烘干至恒重，粉碎備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁標準品0.020 0 g，以60%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于25 mL比色管中，根據文獻[7] 方法測定，以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，用最小二乘法作線性回歸曲線。

1.2.2 黃酮的測定 參照文獻[7]，按式(1)計算黃酮得率。

(1)

式中：

R1——黃酮得率，%；

m1——黃酮質量，g；

m2——荔枝皮質量，g。

1.2.3 篩選分相鹽 根據文獻[14]修改如下：在乙醇體積分數為65%、微波時間為90 s、料液比為1∶40 (g/mL)、微波功率為250 W條件下，比較硫酸銨和磷酸氫二鉀2種分相鹽對荔枝皮中黃酮提取效果的影響。

1.2.4 單因素試驗

(1) 乙醇體積分數：固定料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取時間90 s，考查乙醇體積分數 (55%，60%，65%，70%，75%)對黃酮得率的影響。

(2) 料液比：固定乙醇體積分數65%，微波功率250 W，提取時間90 s，考查料液比[1∶20，1∶25，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對黃酮得率的影響。

(3) 硫酸銨用量：固定乙醇體積分數65%，料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取時間為90s，考查硫酸銨(7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 g/100 mL)對黃酮得率的影響。

(4) 微波輻射時間：固定乙醇體積分數65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸銨10 g/100 mL，微波功率250 W，考查提取時間(30，60，90，120，150 s)對黃酮得率的影響。

(5) 微波功率：固定乙醇體積分數65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸銨10 g/100 mL，提取時間90 s，考查微波功率(200，250，300，350，400 W)對黃酮得率的影響。

1.2.5 Box-Behnken試驗設計 以硫酸銨用量、微波功率、微波輻射時間為試驗因子，黃酮得率為響應值，用 Design Expert 8.0 軟件中Box-Behnken設計進行試驗優化。

1.2.6 清除DPPH·試驗 根據文獻[15]修改為：DPPH·濃度為0.000 2 mol/L，取提取液(黃酮濃度為0.015 g/L) 0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL于25 mL的比色管中，加入DPPH·溶液2 mL，用95%乙醇準確補充至6 mL，搖勻，室溫下避光放置30 min，以60%乙醇作參比，在517 nm 波長下測定吸光值Ai，用同法測定吸光值Ac和Aj，考查提取液清除自由基的性質，并與等濃度的VC和蘆丁進行比對試驗。清除率計算公式：

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——加入DPPH·的待測液吸光值；

Aj——待測液吸光值；

Ac——DPPH·吸光值。

2 結果與討論

2.1 標準曲線試驗

如圖1所示，蘆丁標準曲線方程為A=0.011 1c-0.039 6，相關系數R2=0.999 4。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 分相鹽試驗

在有效分相條件下，硫酸銨和磷酸氫二鉀對照試驗結果：黃酮得率分別為14.65%和11.29%，可知硫酸銨對本材料更有效，同時硫酸銨作為一種酸性鹽，具有溶解度大、易操作特點，適合提取黃酮類物質，故本試驗確定硫酸銨為分相鹽。

2.3 單因素試驗

2.3.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響 如圖2所示，在乙醇體積分數為55%～60%時，黃酮得率隨乙醇體積分數增加有顯著增長，65%時得率達到最高，60%～65%時得率增加不顯著；當乙醇濃度繼續增大時，黃酮得率有下降趨勢，可能是雜質成分溶出競爭力增強和對微波的作用產生了影響，導致黃酮得率降低。因此確定最佳乙醇體積分數為60%。

2.3.2 料液比對黃酮得率的影響 如圖3所示，料液比在1∶25～1∶50 (g/mL)時，黃酮得率隨著溶劑量的增加而增加。料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)時增加顯著，在1∶40～1∶50 (g/mL)時增加較小，考慮到提取劑用量較大時，不僅增加了乙醇用量，增大了后續工序難度，還會導致生產成本增加，綜合考慮選定1∶40 (g/mL)為最佳料液比。

圖2 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

圖3 料液比對黃酮得率的影響

2.3.3 硫酸銨用量對黃酮得率的影響 如圖4所示，黃酮得率隨硫酸銨用量的增加先增加后減少，在硫酸銨用量為10 g/100 mL 時有最大值，但隨著硫酸銨用量增加黃酮量減少，且10 g/100 mL時已出現少許的鹽剩余，分相明顯，綜合考慮，選取硫酸銨用量為10 g/100 mL時最佳條件。

2.3.4 提取時間對黃酮得率的影響 如圖5所示，隨著提取時間延長，黃酮得率先增加后減少，在90 s時有最佳值，之后有減少。可能是最初微波提取時，黃酮溶出起主導作用，但加熱時間過長，微波對黃酮類物質中有效成分結構破壞及降解逐漸凸顯，從而導致得率降低。因此確定最佳提取時間為90 s。

圖4 硫酸銨用量對黃酮得率的影響

圖5 微波輻射時間對黃酮得率的影響

2.3.5 微波功率對黃酮得率的影響 如圖6所示，最初黃酮得率隨著微波功率的增加而增加，在250 W時有最佳值。因為微波功率越大，分子運動越劇烈，提取效率相對會越高，當微波功率過大時，活性分子運動過于劇烈，也加劇了活性物質間發生副作用，導致黃酮得率下降。另一方面也會加劇黃酮有效成分結構被破壞及其他雜質增加而不利于提取。故將250 W作為最佳功率。

圖6 微波功率對黃酮得率的影響

2.4 響應曲面試驗結果

2.4.1 因素水平及編碼 見表1。

2.4.2 響應曲面試驗結果及方差分析 固定乙醇體積分數為60%，料液比為1∶40 (g/mL)，以硫酸銨用量、微波功率、微波時間為變量因子，黃酮得率為響應值，設計三因素三水平Box-Behnken試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

通過 Design Expert 8.0 軟件對17組數據進行回歸分析及擬合，得回歸方程為：

R1=-12.842+3.514 5A+0.150 8B+0.145 3C-0.000 4AB+0.011 667AC-0.000 25BC-0.569A2-0.000 235 6B2-0.000 676 667C2。

(3)

表1 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表

表2 Box-Behnken設計方案及試驗結果

表3 回歸模型方差分析結果?

2.4.3 黃酮得率的響應面分析 試驗因子 A、B、C 所構成的響應曲面圖如圖7～9所示。

從響應曲面圖可形象地看出圖形均為山丘形曲面，有極大值，結合方差分析，可以得出微波功率在交互作用中對黃酮得率的影響最顯著，微波時間的影響次之，硫酸銨用量的影響作用不夠顯著。利用 RMS 預測，通過對各個響應面最高點的極值分析及對最高點取值，并對多元二次回歸方程進行求解，得出各個因子的解，最優工藝條件為：硫酸銨用量9.85 g/100 mL，微波時間91.79 s，微波功率268.03 W，在此條件下荔枝皮中黃酮得率的理論值可達20.947 8%。

2.4.4 驗證實驗 考慮到可操作性，以硫酸銨用量為10 g/100 mL、微波時間為90 s、微波功率為270 W驗證 Box-Behnken 設計試驗所得結果的可靠性，5次平行實驗所得黃酮得率的統計均值為20.74%，與此條件下理論預測值20.94% 的相對誤差為0.97%，表明該優化參數可靠，試驗模型有指導意義。

圖7 因素A和因素B對黃酮得率影響的響應面

Figure 7 Response surface plot about effects of factor A and factorB on yield of flavonoids

圖8 因素A和因素C對黃酮得率影響的響應面

Figure 8 Response surface plot about effects of factor A and factor C on yield of flavonoids

圖9 因素B和因素C對黃酮得率影響的響應面

Figure 9 Response surface plot about effects of factor B and factor C on yield of flavonoids

2.5 對DPPH·的清除效果

如圖10所示，荔枝皮黃酮對DPPH·有一定的消除能力，且隨樣品濃度的增大而增強，在1.5 μg/mL濃度范圍內呈現較好的量效關系，濃度達到0.25～1.50 μg/mL時，荔枝皮黃酮對DPPH·的清除作用好于VC、蘆丁。

圖10 不同清除劑的DPPH·清除率

3 結論

本研究充分利用了微波和雙水相技術的優點，縮短了提取時間，溶劑易于回收。以Box-Behnken方法進行響應曲面設計，建立了微波聯用雙水相提取荔枝皮中黃酮的試驗理論模型，得到的工藝參數為硫酸銨用量10 g/100 mL，微波時間90 s，微波功率270 W，黃酮得率為20.74%；提取物有較好的清除DPPH·的能力，存在較好的量效關系。后續將對黃酮的分離純化及應用作進一步的研究。