茶渣硒蛋白的分離純化及其性質研究

楊 旭 謝 盈

(1. 安康學院現代農業與生物科技學院，陜西 安康 725000；2. 陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000)

茶渣是茶葉經過加工利用后或成品茶經沖泡飲用后的剩余殘渣。中國有眾多茶飲料、茶多酚、速溶茶生產廠家，每年這些廠家產生的茶葉濕廢渣達幾十萬噸之多[1]。依托于中國第二大富硒區安康獨特的地理地質環境，茶葉作為當地名優資源具備天然富硒特色[2-3]。富硒茶中硒的主要賦存形式為硒蛋白，占總硒含量的60.12%，但茶葉中的硒蛋白多為堿溶性，經水浸泡無法溶出而留于茶渣中，占茶渣總量的23.81%之高[4]18。已報道的文獻[4]42-48 [5-6][7]11-17多是對普通茶渣中蛋白的提取及功能性質分析，以及富硒茶葉、茶粉中硒蛋白的提取工藝優化，而關于富硒茶茶渣中硒蛋白的分離純化、性質研究卻未見報道，相關基礎研究的缺乏制約了富硒茶渣資源的開發利用。

本試驗擬以堿提法對紫陽富硒茶沖泡后剩余茶渣中的硒蛋白進行提取，利用脫色、沉淀等方法初步分離純化硒蛋白，并對制備得到的純化硒蛋白中硒有機化程度、氨基酸組成、功能特性及抗氧化活性進行了分析。以期明確硒蛋白的分離純化工藝和相關性質，為茶渣作為茶蛋白的優質資源和硒的富集資源應用于食品加工領域提供研究依據，從而尋求富硒茶及其產品研發的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富硒綠茶：安康紫陽向陽茶廠；

硝酸、鹽酸：優級純，成都科龍化工試劑廠；

牛血清白蛋白(BSA)：上海江萊生物科技有限公司；

1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2, 2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)：日本TCI公司；

XDA-7大孔吸附樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；

硒標準儲備液：1 000 μg/mL，國家標準物質研究中心；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

低速離心機：LD4-2A型，北京醫用離心機廠；

恒溫振動水浴鍋：SHA-C型，常州國華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海躍進醫療器械有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

原子熒光光度計：AFS-930型，北京吉天儀器有限公司；

小型控溫加熱板：ECH-Ⅱ型，上海新儀微波化學科技有限公司；

溫壓雙控微波消解儀：MDS-6型，上海新儀微波化學科技有限公司；

真空冷凍干燥機：SCIENTZ-50N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8900型，日立高新技術公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 富硒綠茶原料按浸泡溫度85 ℃、浸泡時間30 min、沖泡2次、料液比110∶1 (mL/g)的方式[8]進行沖泡后，剩余茶渣置于恒溫干燥箱中，50 ℃下干燥至恒重，粉碎過60目篩備用。

1.2.2 茶渣硒蛋白的提取 稱取上述茶渣樣品1 g，根據預試驗所得的優化提取工藝，用0.075 mol/L NaOH溶液，按1∶60 (g/mL)的料液比于54.2 ℃下水浴振蕩提取4 h，抽濾后浸提液在45 ℃下旋轉蒸發，冷凍干燥。

1.2.3 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍G-250法[9]，以BSA標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。在同樣的反應條件下，取1 mL浸提液進行測定。

1.2.4 茶渣硒蛋白的脫色工藝

(1) 脫色效果的指標測定：根據吳芳[10]的脫色效果評價方法略作修改，采用紫外分光光度計在190～1 100 nm波長內進行光譜掃描，確定最大吸收峰對應波長為216 nm，并在此波長下測定脫色前后浸提液的吸光度，按式(1)、(2)計算脫色率和蛋白質損失率。

DR=[(A1-A2)/A1]×100%，

(1)

式中：

DR——脫色率，%；

A1——脫色前浸提液吸光度；

A2——脫色后浸提液吸光度。

LR=[(P1-P2)/P1]×100%，

(2)

式中：

LR——蛋白質損失率，%；

P1——脫色前浸提液中的蛋白質含量，μg/mL；

P2——脫色后浸提液中的蛋白質含量，μg/mL。

(2) 活性炭脫色法：分別按5∶100，10∶100，15∶100，20∶100，25∶100，30∶100 (g/mL)的比例向浸提液中添加處理活化的活性炭，于90 ℃恒溫水浴下脫色1 h，抽濾后收集脫色液，測定脫色率和蛋白質損失率。

(3) 雙氧水脫色法：分別按0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/100 mL 的比例向浸提液中添加體積分數為30%的雙氧水溶液，室溫下放置于磁力攪拌器上攪拌反應30 min，轉速為200 r/min，而后靜置30 min，測定脫色率和蛋白質損失率，選取最適的雙氧水用量。

(4) XDA-7大孔樹脂脫色法：根據王丹[11]12的大孔樹脂脫色法修改如下，預處理后的XDA-7大孔樹脂采用濕法裝柱(Φ2.5 cm×40 cm)，取蛋白質濃度6.69 mg/mL的茶渣硒蛋白浸提液100 mL進樣，速度控制為1 BV/h。然后用質量濃度為2%的NaOH溶液洗脫至280 nm下無蛋白質特征吸收，收集洗脫液并濃縮至100 mL，測定脫色率和蛋白質損失率。

按確定的雙氧水用量向浸提液中添加后，分別于20，30，40，50，60 ℃下攪拌反應30 min后，靜置30 min，測定脫色率和蛋白質損失率，選取最適的反應溫度。

1.2.5 茶渣硒蛋白的沉淀工藝 根據陸晨[7]15的等電點沉淀法修改如下：向 5 支 30 mL 離心管中各加入20 mL 浸提液，分別調節pH至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，室溫下靜置30 min，并于4 000 r/min離心30 min，棄去上清液后干燥稱重，從而確定最適沉淀點。

1.2.6 茶渣硒蛋白性質

(1) 硒有機化程度：硒元素含量測定參照文獻[12]。準確稱取茶渣硒蛋白樣品2 g，測定其總硒含量后，添加濃鹽酸與水按體積比1∶1混合得到的鹽酸溶液20 mL，超聲波功率250 W下輔助浸提30 min，再于沸水浴中浸提30 min，冷卻后經脫脂棉過濾，測定濾液中無機硒含量，并利用減差法[13]按式(3)計算硒有機化程度。

ROSe=[(TSe-ISe)/TSe]×100%，

(3)

式中：

ROSe——硒有機化程度，%；

TSe——總硒含量，μg/g；

ISe——無機硒含量，μg/g。

(2) 氨基酸組成測定：按GB 5009.124—2016執行。

(3) 溶解性：參照文獻[14]。

(4) 乳化性和乳化穩定性：參照文獻[7]17，配制1 mg/mL 的茶渣硒蛋白液，并調節pH至7.0進行測定。

(5) 起泡性和泡沫穩定性：參照文獻[7]17-18，配制1 mg/mL 的茶渣硒蛋白液，并調節pH至7.0進行測定。

(6) DPPH自由基清除活性：參照文獻[15]。

(7) ABTS自由基清除活性：參照文獻[16]。

(8) 羥基自由基清除活性的測定：采用Fenton-水楊酸反應體系[15]，以紫外分光光度法對其活性進行評價。

1.2.7 數據分析 所有數據以(均值±標準差)表示，每次樣品的測定均重復3次。采用SPSS 19.0進行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05即為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 茶渣硒蛋白的脫色工藝確定

2.1.1 活性炭脫色 圖1為茶渣硒蛋白浸提液脫色率和蛋白質損失率隨活性炭添加量的變化曲線。在受試添加量范圍內，脫色率明顯低于蛋白質損失率，且兩者均隨添加量的增加而提高。當添加量達到25 g/100 mL時，脫色率和蛋白質損失率分別為(47.74±0.40)%和(52.16±0.78)%，而后趨于穩定。這可能是浸提液中的呈色物質與蛋白質結合，被活性炭共同吸附導致。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of activated carbon dosage on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

2.1.2 雙氧水脫色 雙氧水添加量對茶渣硒蛋白浸提液脫色率和蛋白質損失率的影響如圖2所示。脫色率隨添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，當添加量為4.0 mL/100 mL 時，脫色率達到最高(74.07±0.79)%。蛋白質損失率則隨添加量的增加而升高，在4.0～5.0 mL/100 mL 時趨于穩定。因此，雙氧水脫色的最適添加量為4.0 mL/100 mL。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of hydrogen peroxide dosage on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

圖3表明雙氧水脫色溫度對脫色效果指標的影響。從圖3可以看出，脫色率和蛋白質損失率均先隨反應溫度的升高而增大，當反應溫度為50 ℃時，脫色率達到最高為(93.78±0.84)%，此時蛋白質損失率為(44.60±0.66)%。隨后，反應溫度繼續升高，導致雙氧水部分分解，脫色率降低，蛋白質損失率則持續增加。因此，確定最適的反應溫度為50 ℃。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effect of hydrogen peroxide decolorization temperature on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

2.1.3 3種方法的脫色效果比較 在確定的活性炭、雙氧水脫色工藝基礎上，對茶渣硒蛋白浸提液脫色，大孔樹脂脫色則按1.2.4(3)所述方法進行。3種方法的脫色效果如表1所示。

表1 3種方法對茶渣硒蛋白浸提液的脫色效果?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3種脫色方法中，雙氧水脫色法的脫色率明顯高于活性炭和XDA-7大孔樹脂脫色法，而蛋白質損失率則位于兩者之間。活性炭和XDA-7大孔樹脂脫色法對茶渣硒蛋白提取液的脫色效果不理想，表明其中的呈色物質并非以游離狀態存在，而是與蛋白質等物質結合，造成脫色困難，且蛋白質損失率較高[11]29-30。雙氧水的強氧化作用使呈色物質氧化分解，形成低分子物質，而使脫色效果明顯。因此，選擇雙氧水脫色法對茶渣硒蛋白進行脫色。

2.2 茶渣硒蛋白的沉淀工藝確定

表2為不同pH下茶渣硒蛋白沉淀量和沉淀率的測定結果。隨著pH值的增加，沉淀量和沉淀率的變化趨勢一致。當pH 3.5時，茶渣硒蛋白沉淀量最大，為(26.7±0.37) mg，此時沉淀率為(61.33±0.86)%，說明pH 3.5是茶渣硒蛋白的最適沉淀點。

表2茶渣硒蛋白的最適沉淀點結果?

Table 2 Results of optimal precipitation point of selenium-protein from tea residue

pH沉淀量/mg沉淀率/%2.015.9±0.18g36.60±0.41g2.519.3±0.31e44.42±0.71e3.022.5±0.43c51.77±0.99c3.526.7±0.37a61.33±0.86a4.023.5±0.36b54.15±0.82b4.520.4±0.45d46.90±1.04d5.017.2±0.39f39.51±0.90f

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 茶渣硒蛋白的性質

2.3.1 硒有機化程度 根據DB61/T 556—2012 富硒食品及相關產品硒含量標準中富硒茶葉、代用茶及含茶制品硒含量為0.15～5.00 mg/kg，確定本研究選用的茶葉原料達到富硒標準。從表3中可知，茶渣硒蛋白中硒的含量占總硒的22.41%，表明了茶渣作為補硒資源的再利用價值。富硒茶原料和茶渣硒蛋白的硒有機化程度分別達到79.47%和79.37%，說明確定的脫色、沉淀工藝未對硒的賦存形態產生影響，且兩者作為膳食補硒源，具有毒性小，硒的吸收率和生物利用率高等特點[17]。

表3 茶渣硒蛋白中硒有機化程度

2.3.2 氨基酸組成 茶渣硒蛋白的氨基酸組成及含量測定結果如表4所示。測定所含有的16種氨基酸中，包括7種必需氨基酸；必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)、必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)分別為73.88%和42.49%；谷氨酸的含量最高，占總氨基酸的13.01%，其次是天門冬氨酸和亮氨酸，分別為10.47%和10.00%，而蛋氨酸含量最低，為0.82%。從氨基酸的化學性質分類來看，疏水性氨基酸含量達46.04%，表明茶渣硒蛋白具有高疏水性；其他分類的含量變化為：酸性>堿性>不帶電極性。依據FAO/WHO氨基酸參考模式[18]分析，除蛋氨酸+胱氨酸低于推薦值，蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、亮氨酸均高于參考標準，具有較高的營養價值。

2.3.3 功能特性 圖4為茶渣硒蛋白在不同pH值下的溶解性測定結果。在pH 4時，氮溶解性指數最低，此后隨pH的升高而增加，與茶渣硒蛋白的堿溶性一致。受試pH范圍內，氮溶解性指數為(28.35±0.85)%～(52.99±1.59)%，與茶渣硒蛋白較高的疏水性氨基酸含量有關。因此，茶渣硒蛋白在食品加工中的應用，可通過改性的方式提高溶解度來實現。

表4 茶渣硒蛋白的氨基酸組成?

? a. 疏水性氨基酸；b. 堿性氨基酸；c. 酸性氨基酸；d. 不帶電極性氨基酸。

圖4 pH對茶渣硒蛋白氮溶解指數的影響

Figure 4 Effect of pH on nitrogen solubility index of selenium-protein from tea residue

茶渣硒蛋白的乳化和起泡性質見表5。從測定結果來看，茶渣硒蛋白具有較好的乳化性，但低于同條件下的大豆分離蛋白(76.4%)，對乳狀液的穩定能力則優于大豆分離蛋白(63.1%)；起泡性能較差，這與茶渣硒蛋白的溶解性較差有關，維持泡沫的穩定能力較好，但明顯低于大豆分離蛋白(87.4%)[19]35-36。

2.3.4 抗氧化活性 由圖5可知，茶渣硒蛋白對DPPH、ABTS和羥基自由基均具有不同程度的清除活性。在受試濃度范圍內，隨著樣品濃度的增加，清除率均呈持續增強的趨勢，DPPH、ABTS和羥基自由基清除率的IC50值分別為(0.339 7±0.002 5)，(0.508 0±0.012 1)，(0.305 0±0.002 0) mg/mL。因此，對3種自由基的清除能力表現為：羥基自由基>DPPH自由基>ABTS自由基，且對前兩者的清除率均高于李永富[20]31-33報道的茶渣蛋白的，可能是硒與蛋白之間的協同抗氧化作用[21]。

表5 茶渣硒蛋白的乳化和起泡性質

圖5 茶渣硒蛋白的DPPH、ABTS和羥基自由基清除活性

Figure 5 DPPH, ABTS and hydroxyl radical scavenging activity of selenium-protein from tea residue

3 結論

茶渣硒蛋白在堿提過程中，多酚類物質在堿性、濕熱條件下發生氧化反應，使浸提液形成褐色。采用雙氧水脫色，在添加量為4.0 mL/100 mL、50 ℃下，可達到(93.78±0.84)%的理想脫色率。pH 3.5下經等電點沉淀所得的茶渣硒蛋白的性質研究結果表明，其是富硒茶中硒元素的主要富集部位，且有機化程度可達79.37%，滿足了安全補硒的要求；氨基酸組成全面，EAA/NEAA、EAA/TAA的比例符合WHO/FAO的理想模式，谷氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、精氨酸等功能氨基酸均有較高含量；與報道的其他植物蛋白[19]5,35-36[22]的同種功能特性比較，乳化性、乳化穩定性和泡沫穩定性較高，溶解性和起泡性則較低，說明其作為乳化劑應用于食品加工中的潛在可能性；還具有顯著的抗氧化活性，DPPH、ABTS和羥基自由基的清除率均表現出濃度依賴性。與以往的研究[7]44[19]39[20]41-42相比，本研究對富硒茶茶渣中與硒結合蛋白的性質進行了考察，關注了脫色、沉淀工藝對硒形態的影響；硒元素的研究中，添加有機化程度指標以表征硒源的安全性。后續可對茶渣硒蛋白通過改性提高功能特性，并在具體食品模型的應用中進行研究，以利于其資源的合理利用和富硒茶的全面開發。