菌種對固態發酵仔豬配合飼料的影響

■ 管軍軍 張天勇 王志祥

(1.河南農業大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001)

仔豬配合飼料是為了仔豬的健康生長，但是仔豬配合飼料設計與生產中往往存在一些問題：纖維素或木質素含量過高，含有抗原性蛋白，添加劑未合理使用，甚至使用違禁藥品。對于上述問題[1]，近年來，一些研究工作者提出利用生物發酵的方法來解決上述問題[2-4]。篩選一種或幾種益生菌降解飼料中纖維素、抗原蛋白為低聚糖、小肽等營養物質，同時微生物代謝產生各種酶、活性物質有利于動物的消化吸收，益生菌的大量生長不僅提供了優質的菌體蛋白（單細胞蛋白），而且活的益生菌有益于動物腸道的健康，從而有效地降低仔豬腹瀉，提高其抵抗力，也降低了一些動物藥品的使用。因此，生物發酵方法在一定程度上系統地解決了上述問題，而且通過計算飼料成本的提高也在市場接受范圍之內。

目前，發酵飼料研究與生產主要以原料發酵為主，如發酵豆粕[5]。在選擇菌種方面，國內外通常采用的菌種有：乳酸菌、酵母菌、霉菌和芽孢桿菌等[4，6-7]。乳酸菌能夠代謝生成大量乳酸，降低pH值，改善風味，能夠防止雜菌污染，提高發酵飼料的品質。酵母在發酵過程中能夠產生多種生物活性物質，有抗病、強化營養和促進生長的效果。工業中通常利用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵飼料。枯草芽孢桿菌的大分子降解率較高，且耐酸堿及高溫，可以以活菌的形式進入動物腸道，促進斷奶仔豬的腸道發育和養分吸收。

本課題組結合固態發酵飼料的產業化實際情況，在科學設計試驗方案的基礎上系統地研究固態發酵仔豬配合飼料生產技術，在前期系統研究前處理工序及單菌種發酵的基礎上，本研究主要集中不同菌種(枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌)及其不同組合對發酵產品主要營養指標（蛋白）的影響，為固態發酵仔豬配合飼料的實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS-GA15購自潤盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌為河南工業微生物菌種保藏中心提供；上述各菌種經過篩選馴化后，并加以輔料經冷凍干燥制成發酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存備用。仔豬配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

1.2 主要儀器設備

SPX-250B智能型生化培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；JJ-CJ-1FD超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；FA2004B電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 粗蛋白的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發酵產品進行粗蛋白的測定，以干基表示(P)。

1.4 發酵試驗

將菌種發酵劑接種到培養液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30℃條件下振蕩培養，轉速為150 r/min，培養4 h。取發酵劑活化液一種（單菌種發酵）或幾種（混菌發酵）接種到固態發酵培養基[仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水(6∶4)組成，裝料100 g/瓶]上，總接種量為5%，攪拌均勻后，置于培養箱中30℃固態發酵48 h，取樣，50℃條件下干燥成品備用。

1.5 試驗設計

試驗主要研究菌種的不同組合方式對固態發酵仔豬飼料的影響，因此，對雙菌種及三菌種混菌發酵進行研究，菌種配比如表2所示，單菌種發酵作為對比，所有試驗處理均重復3次。

表2 菌種配比

1.6 統計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結果進行多因素方差分析（ANOVA）及最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較。

2 結果與討論

本研究中選用三種常見的固態發酵飼料的菌種作為研究對象，枯草芽孢桿菌屬好氧型，酵母屬兼氧型，而乳酸菌屬厭氧型。從微生物的生長特性上分析，這三種微生物若一起培養的話，理論上會產生一定的拮抗作用。由于固態發酵物質與能量傳遞的不連續性[8]，發酵前期培養基中氧分充足，利于好氧型微生物的生長，因此發酵前期以枯草芽孢桿菌發酵為主；伴隨著局部微環境氧分的減少，逐步利于兼氧型微生物的生長，于是發酵中期以酵母發酵為主；隨著發酵時間的延長，局部微環境的氧分進一步減少，有利于厭氧型微生物生長，那么在發酵后期以乳酸菌發酵為主；所以，在固態發酵環境中，利用其不連續性，可有效地抑制上述三種類型菌種間的拮抗作用。而且，有關枯草芽孢桿菌、酵母及乳酸菌組合進行混菌固態發酵飼料原料的研究已有報道[9]。

2.1 枯草芽孢桿菌與酵母組合固態發酵仔豬配合飼料

不同的枯草芽孢桿菌與酵母組合配比對固態發酵仔豬配合飼料的影響如圖1所示。從統計學的分析結果可以看出，該類菌種組合對于固態發酵仔豬配合飼料均有顯著的影響（P＜0.05），不過，對于固態培養基551H的影響（P＜0.01）比552H（P值接近0.05）更加顯著。對于固態培養基551H（見圖1A），組合B+S(2∶1)發酵后產品的蛋白含量及其增加率明顯高于其它組合及單菌種發酵產品（P＜0.05），而且其它組合及單菌發酵產品之間并無明顯差異(P＞0.05)。對于固態培養基552H(見圖1B)，試驗結果與551H不同，組合B+S(1∶2)發酵后產品的蛋白含量及其增加率明顯高于其它兩種組合及單菌種酵母發酵的產品（P＜0.05），與單菌種枯草芽孢桿菌發酵的產品相當（P＞0.05），但是枯草芽孢桿菌、酵母及組合B+S(1∶1)，B+S(2∶1)的發酵產品在蛋白及其增加率方面無明顯差異（P＞0.05）。總的來說，試驗的結果說明枯草芽孢桿菌與酵母組合可提高單菌種固態發酵仔豬配合料的蛋白含量及其增加率，只是對于不同的配合飼料，最佳的菌種配比不一樣，這應與配合飼料的組成有關。

圖1 枯草芽孢桿菌與酵母組合固態發酵仔豬配合飼料對蛋白含量及其增加率的影響

2.2 枯草芽孢桿菌與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料

枯草芽孢桿菌與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料的影響如圖2所示。經過統計分析發現，這兩種菌種的組合對不同的固態發酵培養基所投制得的發酵產品有很大的區別。對于固態發酵551H(見圖2A），該菌種組合極顯著地影響著發酵產品蛋白及其增長率（P＜0.000 1）；而對于固態發酵552H（見圖2B），該菌種組合對其發酵產品影響不大（P＞0.05）。對于固態培養基551H(見圖2A)，菌種組合B+L(1∶1)、B+L(2∶1)之間差別不大(P＞0.05)，但是明顯高于其它組合及單菌種發酵(P＜0.05)，而且單菌種發酵與組合B+L(1∶2)所得發酵產品之間的差異不明顯（P＞0.05）。至于固態培養基552H(見圖2B)，各種菌種組合及單菌種之間所得的發酵產品之間并無明顯差別(P＞0.05)。由此可知，枯草芽孢桿菌與乳酸菌組合僅僅對于固態發酵仔豬配合飼料551H產品中蛋白及其增加率有著明顯影響，較單菌種發酵產品有著明顯的提高，而對于固態發酵552H的影響不明顯。

圖2 枯草芽孢桿菌與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料對蛋白含量及其增加率的影響

2.3 酵母與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料

酵母與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料的影響如圖3所示。由統計分析可知，該菌種組合對于兩種固態發酵培養基的影響均極顯著（P＜0.001），而且不同菌種組合之間的差異也基本一致：具體來說，組合S+L(1∶1)與S+L(2∶1)固態發酵所得產品的蛋白及其增加率無顯著差異（P＞0.05），且明顯高于其它組合及單菌種發酵產品（P＜0.05），而且組合S+L(1∶2)與單菌種發酵產品之間也無明顯差異（P＞0.05）。因此，酵母與乳酸菌組合非常適合兩種仔豬配合飼料的固態發酵，且可明顯提高單菌種發酵產品的蛋白含量及其增加率。

圖3 酵母與乳酸菌組合固態發酵仔豬配合飼料對蛋白含量及其增加率的影響

2.4 三菌種組合固態發酵仔豬配合飼料

枯草芽孢桿菌、酵母及乳酸菌三菌種組合對于固態發酵仔豬配合飼料的影響如圖4所示。經過統計分析可知，三菌種組合對于兩種固態培養基所制得的產品蛋白含量及其增加率的影響非常顯著（P＜0.001）。對于固態發酵551H（見圖4A），菌種組合B+S+L(1∶1∶1)、B+S+L(2∶1∶1)、B+S+L(1∶2∶1)、B+S+L(2∶2∶1)、B+S+L(2∶1∶2)之間對于發酵產品的影響無明顯差別（P＞0.05），但是產品的蛋白含量及其增加率明顯高于其它菌種組合及單菌種所得產品（P＜0.05）。組合B+S+L(1∶1∶2)及B+S+L(1∶2∶2)與單菌種之間的差別不明顯（P＞0.05），但是前者所得產品的蛋白含量及其增加率明顯高于后者（P＜0.05）。對于固態發酵552H（見圖4B），菌種組合B+S+L(1∶1∶1)，B+S+L(2∶1∶1)，B+S+L(1∶2∶1)，B+S+L(2∶2∶1)，B+S+L(1∶2∶2)的差異并不顯著（P＞0.05），但是該類組合所得發酵產品蛋白含量及其增加率明顯高于其它菌種組合（P＜0.05），而其它組合及單菌種之間差異也不明顯（P＞0.05）。由試驗可知，三菌種組合固態發酵仔豬飼料551H與552H，適當的配比能有效提高單菌種發酵產品的蛋白含量及其增加率。

圖4 三菌種組合固態發酵仔豬配合飼料對蛋白含量及其增加率的影響

2.5 討論

2.5.1 雙菌種組合

在雙菌種組合混菌固態發酵仔豬配合飼料的試驗結果中，對影響較為顯著的蛋白含量及其增加率較高的組合進行統計分析，各菌種在組合中的占比如表3所示。對于固態培養基551H，最佳組合中，枯草芽孢桿菌于組合中其占比在1/2之上，乳酸菌占比在1/2之下，而酵母處于1/3～2/3之間，由此可知，對于雙菌種固態發酵551H，枯草芽孢桿菌在組合中的比例較大，乳酸菌比例較小，可獲得較好的發酵效果。那么，對于固態培養基552H，最佳組合中，枯草芽孢桿菌于組合中其占比在1/3較為合理，酵母占比在1/2之上，而乳酸菌處于1/2之下，因此，酵母在菌種組合中處于較大的比例，而乳酸菌與枯草芽孢桿菌比例較小。

表3 雙菌種混菌發酵產品中蛋白含量及其增加率較高（P＜0.05）的組合中各菌種占比

從各菌種的占比大小可知，雙菌種組合混菌固態發酵仔豬配合飼料過程中，對于不同的固態培養基，各菌種的占比是不一樣的。一方面是由于兩種配合飼料的營養組成不同所致，如表1所示，551H中含有氨基酸等易于微生物生長的營養物質，而552H配方中則沒有體現出來；另一方面，上述任意兩種微生物組合理論上不可避免地會出現拮抗作用，雖然固態發酵體系物質與能量傳遞的不連續性[8]，有避免拮抗作用的優勢，但是若組合中各菌種占比不當的話，發酵微環境中可利用營養物質的有限性將導致菌種生長的可持續性；具體來說，551H中易于微生物利用的營養物質較552H豐富，適于發酵前期好氧型的枯草芽孢桿菌的生長，因此，提高該菌種在組合中占比有利于快速消耗氧分，再加上營養組分充足，利于兼氧型酵母或厭氧型乳酸菌的生長；而固態發酵552H中，由于可有效利用的營養物質有限，提高好氧型的枯草芽孢桿菌的占比，在微環境中氧分的快速耗盡的同時，可利用的營養組分也基本耗盡，反而不利于兼氧型酵母或厭氧型乳酸菌的生長，所以，組合中枯草芽孢桿菌的比重較小。另外，由于發酵前期好氧環境不利于乳酸菌生長，若該菌種比重過大，將會影響其它微生物的快速生長，導致發酵效率下降，因此，乳酸菌在菌種組合中的占比較小。

2.5.2 三菌種組合

在三菌種組合混菌固態發酵仔豬配合飼料的試驗結果中，對影響最顯著的組合進行統計分析各菌種在組合中的占比如表4所示。與雙菌種組合不同的是，各菌種最大占比不超過1/2，最低占比情況因不同的固態培養而有所不同：對于551H，枯草芽孢桿菌最小占比不低于1/4，而酵母與乳酸菌最小占比不低于1/4；對于552H，枯草芽孢桿菌與乳酸菌最小占比不低于1/5，而酵母最小占比不低于1/4。由此可知，在三菌種混菌固態發酵中，任何一菌種在組合中所占最大比例不得超過1/2，否則不利于其它微生物的生長，這應與三種不同類型的菌種共同存在下，過大的占比會提高菌種之間的拮抗性。那么在菌種最低占比情況下，應與固態培養基有關；與雙菌種類似，營養組成不一樣，菌種在組合中的最小占比不一樣；在551H培養基中，枯草芽孢桿菌最小占比可在1/4之上，比其它兩種菌種高；而在552H培養基中，酵母最小占比較其它兩種菌種高；這是因為551H中微生物可利用的營養成分顯然要比552H多（表1），具體原因如同雙菌種一樣（見2.5.1）。

表4 三菌種混菌發酵產品中蛋白含量及其增加率較高（P＜0.05）的組合中各菌種占比

3 結論

本研究選用枯草芽孢桿菌、酵母及乳酸菌為主要菌種，對仔豬配合飼料551H及552H進行固態發酵，通過不同的菌種組合及配比，探討菌種對于固態發酵仔豬配合飼料的影響，結論如下：

①通過調節菌種組合中各微生物的占比，混菌（雙菌種或三菌種）固態發酵仔豬配合飼料所得產品在蛋白含量及其增加率方面可顯著高于單菌種發酵產品（P＜0.05）。

②對于固態培養基551H，雙菌種最佳組合中，枯草芽孢桿菌于組合中其占比在1/2之上，乳酸菌占比在1/2之下，而酵母處于1/3～2/3之間；三菌種最佳組合中，枯草芽孢桿菌最小占比不低于1/3，而酵母與乳酸菌最小占比不低于1/4。

③對于固態培養基552H，雙菌種最佳組合中，枯草芽孢桿菌于組合中其占比在1/3較為合理，酵母占比在1/2之上，而乳酸菌處于1/2之下；三菌種最佳組合中，枯草芽孢桿菌與乳酸菌最小占比不低于1/5，而酵母最小占比不低于1/4。

本研究所取得的成果將為混菌固態發酵仔豬配合飼料提供一定的理論指導，當然，有關混菌特別是不同類型的菌種組合進行固態發酵仔豬配合飼料仍需要進一步研究，如一步法發酵過程的控制等。