大菱鲆源鰻弧菌的分離鑒定及藥敏分析

■ 欒林林 張永剛 王鳳軍 任 媛 任 海 李 強 靳曉敏*

（1.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇連云港222002；3.河北科技師范學院河北省預防獸醫學重點實驗室，河北昌黎066600）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）音譯名“多寶魚”，俗稱歐洲比目魚[1]，因其具有較高的經濟效益，目前已成為我國海水養殖魚類產量最大的品種[2]。隨著大菱鲆養殖規模和產量逐年擴大，及高密度工廠化養殖技術的推廣，在養殖過程中其細菌性疾病頻發。國內外相關報道，目前細菌性疾病的主要病原以弧菌為主，包括鰻弧菌（V.anguillarum）、哈維弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、殺鮭弧菌（V.salmonicida）、燦爛弧菌（V.splendidus）等[3-4]。

2017年5月，河北昌黎某養殖場大菱鲆發生病害并伴有死亡，主要癥狀為鰓蓋、體表有出血點，腹腔膨脹有積液，肝臟、脾臟充血或出血，腸道內有淡黃色黏液。筆者從患病大菱鲆肝臟中分離獲得一株優勢菌DLP-1，對其進行人工感染試驗。攻毒試驗顯示大菱鲆死亡率高達85%，并從肝臟中分離到該菌，證明其為此次發病的病原菌。并通過對該菌的主要理化性狀及16S rRNA基因序列鑒定，結合構建系統發育樹表明，該病原菌為鰻弧菌（Vibrio anguillarum）。同時對該菌的藥物敏感性進行檢測。旨在明確其病原菌及敏感藥物，為大菱鲆健康養殖及疾病防治提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 病魚來源

患病及瀕死大菱鲆均取自河北昌黎某大菱鲆養殖場，體長約25 cm，體重400～500 g。試驗用健康大菱鲆取自河北昌黎另一大菱鲆養殖場，規格相似，于水溫18～19℃條件下暫養7 d。

1.2 試驗試劑

ATB自動鑒定系統及ID32E細菌鑒定試劑條購于法國梅里埃生物公司；TianGen細菌基因組DNA提取試劑盒及引物均購于上海生工生物工程股份有限公司；普通營養瓊脂購于北京陸橋生物技術有限責任公司；藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司；五倍子等24種中草藥均購于河北昌黎百草堂大藥房。

1.3 病原體的分離鑒定

在無菌情況下，用接種環取患病大菱鲆肝臟等組織接種于普通營養瓊脂，28℃倒置培養24～48 h，根據菌落大小、顏色、邊緣光滑程度等形態學特征對細菌進行分離純化。將純化后的菌株置于20%甘油的保種液中，-80℃冰箱保存。

挑取純化培養的單菌落，用滅菌生理鹽水稀釋后進行涂片革蘭氏染色，用顯微鏡觀察細菌形態，拍照。吸取40 μl菌懸液加入ID32E生化鑒定試紙條的各孔中，在需厭氧培養的孔中加入礦物油，置于濕盒，28℃培養12～24 h；次日在吲哚試驗孔加入1滴James，將試紙條置于ATB自動鑒定系統中進行鑒定。

在無菌條件下接種純培養菌于5 ml營養肉湯中，28℃110 r/min振蕩培養16 h。采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行細菌DNA的提取。利用細菌16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′)對細菌總DNA的相應序列進行擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后進行測序。將測得16S rRNA基因序列與NCBI數據庫核酸序列進行BLAST比對分析，并構建系統發育樹，結合其理化特性對菌種進行歸類判定。

1.4 動物回歸感染試驗

選取體色正常、活力旺盛的大菱鲆個體分為試驗組和對照組，每組10尾，均設置3個平行。將分離菌接種到肉湯培養基中搖菌，28℃培養過夜，取1 ml菌液于1.5 ml離心管，3 000 r/min離心2 min，棄去上清液，制成菌懸液。參考沈萍等[5]的方法，將菌懸液濃度調為5.0×108CFU/ml。采用腹腔注射法進行攻毒試驗，每尾注射0.2 ml。對照組大菱鲆注射等量無菌生理鹽水。試驗周期為7 d，間隔6 h觀察大菱鲆有無異常情況，并記錄試驗魚發病及死亡情況。

如人工感染的試驗魚癥狀與自然發病魚相同或相似，則再次細菌分離鑒定，以明確病原菌。如經人工感染后發病癥狀與原癥狀不同則排除初次分離菌。

1.5 病原菌的藥敏試驗

采用紙片擴散法（K-B法）。用滅菌棉簽蘸取稀釋后的菌懸液，均勻涂布于營養瓊脂平板表面，將氟苯尼考等22種藥敏紙片貼于平板表面，每個培養皿貼6片，28℃培養24 h，觀察抑菌圈情況，用直尺測量抑菌圈直徑。藥敏結果判定標準參考NCCLS手冊2017版。

參考張永剛等[6]的方法制備中草藥液，并在其基礎上略加改進。將得到的中草藥液經高壓滅菌121℃15 min后，置于4℃冰箱冷藏備用。采用牛津杯打孔法，對五倍子等24種中草藥進行藥敏試驗。用滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻涂布于普通營養瓊脂打孔培養基上，每孔各加入180 μl各中草藥原液，28℃培養24 h后查看結果，每種中草藥3個平行。判定標準參考葉應嫵[7]編寫的《全國臨床檢驗操作規程》，抑菌圈直徑≥20 mm判定為高度敏感(S)、10～19 mm為敏感(I)、小于10 mm的為耐藥(R)、無抑菌圈形成(記作 0)。

采用96孔酶標板，微量二倍稀釋法測定MIC和MBC[8]。

2 結果

2.1 細菌培養特性

在普通營養瓊脂平板接種純化病原菌，28℃培養24 h，DLP-1為圓形光滑、邊緣整齊、較隆起不透明、淡黃色菌落，直徑約0.8～1.0 mm（圖1）。革蘭染色為陰性、兩端鈍圓的短桿狀，有的菌體彎曲呈弧形（圖2）。

圖1 菌株DLP-1培養形態

圖2 菌株DLP-1革蘭氏染色（H.E.，100×）

2.2 菌株DLP-1生理生化特性

從表1可知，d-葡萄糖、過氧化氫酶、吲哚及賴氨酸脫羧酶陽性；精氨酸雙水解酶、硫化氫陰性；參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌學鑒定手冊》中弧菌屬的特征，對菌株DLP-1進行分類地位的鑒定，初步鑒定篩選菌株屬于弧菌科。

表1 菌株DLP-1的生理生化特性

2.3 16S rRNA基因序列測定結果及菌種判定

采用通用引物對菌株DLP-1的16S rRNA PCR擴增產物進行序列測定，使用Blast軟件對所獲得測序結果在NCBI數據庫進行序列相似性比對分析，系統發育樹如圖3所示。結果表明，本研究分離獲得的菌株DLP-1屬于弧菌科弧菌屬(Vibrio)，與鰻弧菌(Vibrio anguillarumDSM 21597 CP010084)的相似性為99%。

2.4 人工感染試驗結果

試驗組魚在感染后第2 d活力減弱，體表背側出現紅色瘡口、尾鰭末端潰爛，腹部膨脹、局部有潰爛灶、鰓糜爛。解剖可見腹腔充滿積液，腸內充滿淡黃色黏液，膽囊發黑、肝臟蒼白，與自然發病魚癥狀相同。取瀕死魚血液、肝、脾接于普通營養平板上分離純化，經鑒定與分離菌株特性相同，通過16S rRNA基因序列分析鑒定為鰻弧菌，對照組魚正常。

2.5 藥物的敏感性測定

圖3 基于16S rRNA基因序列的菌株DLP-1系統發育樹

2.5.1 西藥敏感性結果(見表2)

由表2可知，氟苯尼考、慶大霉素和他唑巴坦等11種藥物對鰻弧菌的抑菌作用最明顯，抑菌圈直徑最大，為理想的抑菌藥物；對四環素、氨芐西林及克林霉素等11種藥物耐藥。

2.5.2 中草藥敏感性結果（見表3、表4）

表2 22種藥物對鰻弧菌的抑菌效果

表3 24種中草藥對鰻弧菌的抑菌效果

由表3可見：五倍子、菌陳、黃岑、烏梅及赤芍五種中草藥對鰻弧菌的抑菌作用最明顯，抑菌圈直徑最大，為理想的抑菌藥物；對梔子、連翹等10種中草藥敏感；對車前子、白頭翁及益母草等9種中草藥耐藥。

表4 優選中草藥對鰻弧菌的MIC和MBC的影響

由表4可見，在優選中草藥中，五倍子抑菌、殺菌效果最強，MIC為1.512 5 mg/ml、MBC 12.5 mg/ml，烏梅、黃岑、連翹及梔子抑菌、殺菌效果較強，而赤芍及菌陳抑菌效果最弱，MIC均為50 mg/ml，且未檢測出其MBC。

3 討論

本試驗挑選常用中草藥24種、西藥22種，以患病大菱鲆分離得到的鰻弧菌DLP-1為供試菌，進行抑菌藥物的篩選。結果表明，DLP-1對氟苯尼考、頭孢唑啉、慶大霉素等藥物高敏，抑菌圈直徑均在20 mm以上。張昕等[9]用8種常用抗生素藥物對四種海洋致病弧菌進行藥物敏感性測試，結果表明鰻弧菌對氯霉素、慶大霉素具有敏感性，但對卡那霉素、青霉素等其他所測藥物均表現出耐藥性。本試驗抑菌效果與其相似，但鰻弧菌對抗生素的敏感性有差異，可能不同地區大菱鲆患鰻弧菌后使用的藥物不同從而導致敏感性不同，也可能由于不同地區菌株有所差異導致結果不同。

在中草藥抑菌試驗中，DLP-1對五倍子、赤芍、菌陳、烏梅、黃岑高敏，其中五倍子抑菌、殺菌效果最佳，MIC為1.512 5 mg/ml，MBC為12.5 mg/ml。梁利國等[10]用4種常用中草藥對病原弧菌（鰻弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、河口弧菌）體外抗菌效果作出了研究，其中蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮4種中草藥具有較好的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC分別為1.56～3.12 mg/ml和3.12～6.25 mg/ml；張明等[11]用20種中藥對鰻弧菌抑菌殺菌作用研究發現，黃芩、五倍子、石榴皮等5種中藥對鰻弧菌的抑菌作用效果顯著，MIC和MBC分別為3.125 mg/ml和6.25 mg/ml。本試驗抑菌效果與其相似，但抑菌濃度卻是其10倍以上。可能是不同菌株間對藥物的敏感性有差異，這點從梁利國等對四種弧菌的測定結果可以證實；也可能由于試驗方法及藥物的熬制方法不同，導致結果有所差異。但本試驗只進行了中草藥的體外抗菌試驗，其結果可作為中草藥防治鰻弧菌感染的依據，在實際生產中的應用效果有待進一步驗證。