固態發酵木薯酒精渣生產生物飼料的研究

■ 李 潔 李 昆 張孟陽 王德培，4*

(1.工業微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.中糧（北京）飼料科技有限公司，北京102209；3.天津科技大學生物工程學院，天津300457；4.省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457）

木薯酒精渣是全木薯發酵制取酒精后的副產物，水分含量高達85%而且酸度大，并含大量粗纖維和粗灰分，無法在常溫下保存，極易腐敗變質造成環境污染，即使作為飼料進行飼喂，適口性比較差，動物難以消化吸收，成為木薯全渣發酵酒精的主要固廢物，是生產企業無法處理的固廢污染難題。以木薯酒精渣為主要原料進行發酵飼料研制，人為控制的條件下，以工業副產物木薯渣為主要原料，以玉米淀粉渣、玉米皮、濕法糖渣等工業副產品作為碳源和氮源的補充料，添加碳酸鈣等作為緩沖劑，通過枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物自身的生長代謝作用，改變木薯渣的物理、化學性質。具體就是分解部分粗纖維、粗蛋白等大分子物質，生成單糖、雙糖、氨基酸等小分子物質，不僅提高了飼料的消化吸收率，而且起到深度生化加工作用[1]。微生物發酵過程中產生并積累大量營養豐富的微生物菌體蛋白及其它有用的代謝產物，如有機酸、醇、酯、維生素、微量元素等，使飼料變軟變香，增加營養，最終形成適口性好、營養豐富、活菌含量高的生物飼料[2]。湯小朋等[3]研究黑曲霉固態發酵對木薯渣品質的影響，最優條件發酵后結果表明：與對照組相比，以干物質為基礎，粗纖維含量由22.26%降低到17.71%，還原糖含量由1.42%提高到5.11%，粗蛋白質含量由8.67%提高到13.48%，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%，粗灰分含量由6.02%提高到7.31%，顯著提高木薯渣的營養價值。畜禽日糧中添加木薯渣的研究很多，蔣建生等[4]研究表明，在肉鴨育雛期（1～14日齡）添加1%發酵木薯渣飼料替代全價飼料有利于促進雛鴨飼料轉化。潘慧華等[5]研究結果表明，在肉用鴨的0～2周齡、3～4周齡和5～7周齡日糧中分別添加2%、4%和8%的木薯渣用來替代三七糠既能滿足肉鴨對粗纖維的需求，同時降低飼料的成本。于向春等[6]用不同復合菌劑發酵木薯渣，以不同的比例進行混合替代文昌雞飼料，結果對文昌雞的生長影響不大，所以發酵木薯渣可替代部分文昌雞飼料以降低成本。張偉濤等[7]將不同發酵方式處理后的木薯渣添加到羅非魚的飼料中，既能被魚體充分吸收利用，又能滿足羅非魚正常的營養需求。蔡永權等[8]研究表明，以青貯木薯渣為主料，搭配2 kg精料添加，18～25月齡肉牛平均日增重達到0.591 kg，飼養成本被降低，質量增速較快，可以獲得不錯的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5；產乳酸菌：凝結芽孢桿菌、發酵乳桿菌，均由本實驗室保藏。

1.2 木薯渣固體發酵飼料配方

木薯渣70%、玉米淀粉渣20%、玉米皮10%。

1.3 培養方法

1.3.1 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，NaCl 10 g/l，pH值7.2。

肉湯培養基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨10 g/l，NaCl 5 g/l，pH值7.2～7.4。

淀粉培養基：牛肉膏5 g/l，蛋白胨5 g/l，NaCl 5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，瓊脂18 g/l，pH值7.2。

MRS培養基：蛋白胨10 g/l，牛肉膏10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，葡萄糖 5 g/l，CH3COONa 5 g/l，檸檬酸二胺2 g/l，吐溫-80 1 g/l，K2HPO42 g/l，MgSO4·7H2O 0.2 g/l，MnSO4·7H2O 0.05 g/l，CaCO320 g/l，pH值6.2。

麥康凱瓊脂培養基：蛋白胨20 g/l，乳糖10 g/l，牛膽鹽 5 g/l，NaCl 5 g/l，中性紅0.03 g/l，瓊脂18 g/l，pH值7.0。

1.3.2 芽孢桿菌種子液制備

從LB培養基斜面上挑取1環菌，接入到裝有50 ml肉湯培養基的250 ml三角瓶中，放置于溫度37℃、轉速200 r/min的搖床中振蕩培養12 h。

1.3.3 產乳酸菌種子液制備

從MRS液體培養基中吸取1 ml培養液，接入到裝有50 ml MRS液體培養基的250 ml廣口瓶中，放置于溫度37℃的恒溫培養箱中靜置培養20 h。

1.3.4 木薯渣固態發酵飼料

將枯草芽孢桿菌BI1、枯草芽孢桿菌B10-5、凝結芽孢桿菌、發酵乳桿菌菌液按比例與一定量的水混合，然后與木薯渣飼料混勻，裝入發酵袋中培養。

1.3.5 乳酸含量的測定

準確稱取發酵飼料5.00 g置于裝有50 ml蒸餾水的250 ml的三角瓶里，充分搖勻并浸提1 h，之后離心取上清液，稀釋相應倍數后用生物傳感分析儀測定其中的乳酸含量。

1.3.6 活菌數的測定[9]

芽孢桿菌用可溶性淀粉固體培養基作為計數培養基；產乳酸菌用MRS固體培養基作為計數培養基；大腸桿菌用麥康凱固體培養基作為計數培養基。

1.4 發酵條件的單因素優化

1.4.1 兩株芽孢桿菌混合比例的確定

選取兩株芽孢桿菌比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3這5個水平進行分析。

1.4.2 兩株產乳酸菌混合比例的確定

選取兩株產乳酸菌比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3這5個水平進行分析。

1.4.3 芽孢桿菌與產乳酸菌混合比例的確定

選取芽孢桿菌與產乳酸菌比例為1∶2、2∶1、1∶1、3∶1、3∶2這5個水平進行分析。

1.4.4 總接種量的確定

選取接種量為1%、3%、5%、7%、9%這5個水平進行分析。

1.5 發酵溫度的確定

選取溫度為22、27、32、37、42 ℃這5個水平進行分析。

1.6 發酵條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取影響顯著的因素進行正交試驗。采用L9(33)型三水平三因素正交表，以芽孢菌與乳酸菌的接種比例、接種量、發酵溫度3個因素作為考察因素，研究對發酵結果的影響。

1.7 育肥豬飼喂試驗

1.7.1 試驗動物和分組

將120日齡60頭70 kg左右的健康的“杜×大×長”三元雜交生長肥育豬隨機分成4組，每組3個重復，每個重復5頭豬。

1.7.2 試驗日糧與設計

試驗設4個處理組，即對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組，分別飼喂0、5%、15%、25%不同比例木薯渣發酵飼料的基礎日糧(見表1)?；A日糧營養水平參照NRC(2012)推薦量平衡日糧中的能量和各種營養物質。

表1 基礎日糧組成和營養水平(風干基礎)

1.7.3 飼養管理

進豬前要檢查維修圈舍設備，并清掃圈舍，然后用2%火堿水溶液或其它消毒藥消毒。按豬的體重、體質強弱等相近的原則分4組，每組3個重復，每個重復5頭。進入豬舍后，舍內溫度控制在16～21℃之間，相對濕度50%～70%之間，保持空氣流通。自由采食，自由飲水，采用全自動飲水裝置，預試期為3 d，正試期為30 d，每天清掃圈舍和除糞2次，保證豬舍內環境衛生良好，每周舍內通道用2%火堿溶液或其它消毒藥消毒1次。平時經常觀察豬群采食、排糞情況、健康狀況和精神狀態，發現疫病及時隔離治療。每周統計試驗豬采食量和增重，及時檢測試驗豬糞便中的微生物。

1.7.4 測定指標

生長性能指標：分別于試驗的開始和結束對所有試驗豬進行空腹稱重，根據每個圈舍試驗豬的總重量和頭數來計算平均頭重，再根據平均頭重的初重和末重來計算出平均日增重。每周要記錄各組試驗豬的采食量，試驗結束后結算各組試驗豬消耗飼料的總重，計算出平均日采食量。根據平均日增重和平均日采食量計算料重比。

糞便中微生物的測定：分別在試驗第15 d和第30 d時，即整個試驗時期的中期和末期，進行豬糞便中微生物的測定，分別取每組試驗豬1 h內的新鮮豬糞，并盡量取多只豬的糞便，然后混勻，準確稱取糞便5 g置于裝有生理鹽水的三角瓶中，瓶內預置適當數量的玻璃珠，震蕩15 min，使糞便中的微生物懸浮于生理鹽水中，然后用十倍稀釋法進行稀釋，選取合適的稀釋梯度進行涂布計數。乳酸菌用MRS培養基作為計數培養基，大腸桿菌用麥康凱培養基作為計數培養基。

1.8 數據處理

采用SPSS16.0統計分析軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 木薯渣發酵飼料兩株枯草芽孢桿菌混合比例的優化（見表2）

表2 兩株芽孢菌混合比例對木薯渣發酵飼料的影響

從表2可以看出，兩株枯草芽孢桿菌的比例對乳酸含量和活菌總數都有影響，但影響都較小，比例為1∶2時，活菌總數有較高水平，乳酸含量也最高，從而確定木薯渣發酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2。

2.2 木薯渣發酵飼料兩株產乳酸菌發酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌混合比例的優化（見表3）

從表3可以看出，兩株產乳酸菌的混合比例為1∶2時，活菌總數最高，但乳酸含量較低，當比例為1∶3時，乳酸含量最高，活菌總數也處于較高水平，從而確定木薯渣發酵飼料中發酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌的比例為1∶3。

2.3 木薯渣發酵飼料芽孢桿菌與產乳酸菌混合比例的優化（見表4）

木薯渣發酵飼料中兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2，發酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌的比例為1∶3，而芽孢桿菌與產乳酸菌混合接種比例見表4。

從表4可以看出，芽孢桿菌與產乳酸菌混合比例對乳酸菌數影響相對較小，芽孢桿菌與產乳酸菌混合比例為3∶2時，乳酸含量最高，且乳酸菌數也有較高的水平，所以確定木薯渣發酵飼料中芽孢桿菌與產乳酸菌比例為3∶2。

表3 兩株產乳酸菌混合比例對木薯渣發酵飼料的影響

表4 芽孢桿菌與產乳酸菌混合比例對木薯渣發酵飼料的影響

2.4 木薯渣發酵飼料總接種量的優化

木薯渣發酵飼料中芽孢桿菌與產乳酸菌比例為3∶2，總接種量見表5。

表5 接種量對木薯渣發酵飼料的影響

從表5可以看出，當接種量超過5%以后，隨著接種量的增加，乳酸含量增加效果并不明顯，而且接種量太高，在生產過程中發酵飼料所需要的菌液也會很高，這樣會增加生產成本，從結果可以看出，5%的接種量各個指標也處于較高水平，所以最終確定接種量為5%。

2.5 木薯渣發酵飼料溫度的優化

兩株枯草芽孢桿菌BI1和B10-5的比例為1∶2，發酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌的比例為1∶3，木薯渣發酵飼料中芽孢桿菌與產乳酸菌比例為3∶2，總接種量5%。發酵溫度見表6。

表6 溫度對木薯渣發酵飼料的影響

從表6可以看出，在22℃和27℃較低溫度木薯渣飼料不能很好地進行發酵，乳酸含量和產乳酸菌數很低，這說明低溫使菌體的生長代謝受到抑制，從而影響產酸性能。在42℃較高溫度下發酵雖然能達到一定的發酵效果，但是溫度過高也會抑制菌株的生長，致使乳酸菌數少于在32℃和37℃發酵的結果。從結果可以看出，37℃下發酵效果很好，乳酸含量和乳酸菌數都達到較好的結果。

2.6 發酵條件的正交試驗

以單因素優化的發酵條件，采用L9(33)型三水平三因素正交試驗研究芽孢桿菌與產乳酸菌的接種比例、總接種量、發酵溫度對發酵結果的影響，結果見表7。

表7 正交試驗設計各因素及水平

以乳酸含量作為指標進行分析，如表8和表9所示。

表8 正交試驗極差分析

表9 以發酵飼料中乳酸結果進行正交試驗方差分析

通過正交試驗中各組發酵產生的乳酸進行分析可以看出各因素無顯著性影響，影響因子的主次順序為：發酵溫度＞接種比例＞接種量，從K值可以看出，A2B2C3發酵產生的乳酸最多，接種比例為3∶2，接種量為5%，發酵溫度37℃。對A2B2C3這一組再次重復進行發酵驗證，測得發酵后乳酸含量達到2.0%。

2.7 木薯渣發酵飼料對育肥豬生長性能的影響（見表10）

育肥豬飼喂到150日齡時，由表10可知，對照組末重遠高于試驗Ⅲ組，差異顯著，略高于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組的末重較為一致，也高于試驗Ⅲ組。從平均日增重來看，試驗Ⅱ組添加15%木薯渣發酵飼料的結果最高。從料肉比來看，對照組料肉比最低，與試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組差異并不大，但低于試驗Ⅲ組的結果，可見添加適量木薯渣發酵飼料的可以刺激試驗育肥豬的采食，但是不宜添加過量。

2.8 育肥豬糞便中微生物的測定（見表11）

表10 木薯渣發酵飼料對育肥豬生長性能的影響

表11 豬糞中微生物的檢測結果

通過對各組豬糞中大腸桿菌數、乳酸菌數以及芽孢桿菌數的測定，從表11可以看出，試驗Ⅱ組乳酸菌數最高，芽孢桿菌數也有較高水平，但四組之間沒有顯著差異。飼料經過發酵后，豬采食后未能改善豬腸道內微生物環境，也可能與飼喂時間短有關。

3 結論

按最優發酵工藝進行發酵，總接種量為5%，枯草芽孢桿菌BI1與枯草芽孢桿菌B10-5接種比例為1∶2，產乳酸菌發酵乳桿菌和凝結芽孢桿菌接種比例為1∶3，芽孢桿菌與產乳酸菌接種比例為3∶2，發酵溫度為37℃，發酵后木薯渣乳酸含量達到2%。添加不同比例木薯渣發酵飼料的基礎日糧進行育肥豬飼喂試驗，結果顯示飼喂添加15%木薯渣發酵飼料的基礎日糧的試驗組具有較好的增重效果，平均日增重0.78 kg，平均日采食量2.8 kg，料肉比3.59，同時腸道內乳酸菌數量增加。由此可見，木薯渣發酵飼料可以部分代替基礎日糧添加，并且具有較好的飼喂效果。