芋螺毒素ImI的化學合成及其殺蟲活性研究

吳小英，安婷婷，高炳淼

1海南省人民醫院；2海南省藥物研究所，海口 570311；3海南醫學院，海口 571199

芋螺(Cone Snail)主要生長于熱帶海域，屬于軟體動物門，腹足綱，芋螺科，是在沿海珊瑚礁、沙灘上生活的美麗的螺類[1]。芋螺毒素(conotoxins)是來源于芋螺毒管中用于捕獵的一類多肽的集合，其具有豐度高、分子量小、結構多樣、靶點廣泛、特異性強等特點，已經逐漸成為國內外極受關注的新興研究熱點[2,3]。全世界約有500種以上芋螺，根據芋螺食性可分為三大類：食蟲芋螺(大于350種)，食螺芋螺(約70種)，食魚芋螺(約70種)[4,5]。我國芋螺約有80余種，主要分布在海南省管轄的西沙群島、南沙群島和中沙群島，以及臺灣島等熱帶海區[6]。至今，已從數百種芋螺中分離到了上千種芋螺毒素，其在鎮痛、癲癇治療、癌癥、戒煙戒毒、疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應用價值[7]。部分芋螺毒素已進入臨床研究或已被FDA正式批準為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮痛藥[8]。如由Olivera等從幻芋螺(Conus magus)中分離的ω-MVIIA，已被美國FAD正式批準為治療頑痛的藥物，其商品名為Ziconotide[9]。

隨著化學殺蟲劑的普遍使用，農業害蟲的耐藥性不斷增加，導致殺蟲劑毒性和使用量都越來越大，生態環境受到巨大傷害，進而嚴重威脅著人類健康，由此對新型、高效、安全生物殺蟲劑的需求非常迫切[10,11]。食蟲芋螺毒素能夠特異性作用于昆蟲而具有較強的殺蟲能力，對哺乳動物的毒性很小或無毒副作用，而食蟲芋螺毒素的殺蟲活性和作用靶點尚未展開系統研究[12]。因此，開展食蟲芋螺毒素的研究，篩選獲得高效殺蟲芋螺毒素，為解決化學農藥造成的生態環境問題提供一條新途徑。本研究化學合成了芋螺毒素線性肽ImI，經兩步氧化法后質譜鑒定獲得氧化折疊肽ImI，采用MTT法和昆蟲注射法測試其殺蟲活性，可為研發新型、高效、安全生物殺蟲劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多肽合成相關氨基酸活化試劑(ABI，美國)；色譜級三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA )和色譜級乙腈(Acetonitrile，ACN)，購自Thermo Fisher Scientific公司；Vydac分析型C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)及制備型C18柱(10 μm，22 mm×250 mm)，購于上海申越實驗器材有限公司。其他常用生化試劑均為國產分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.2 實驗儀器

多肽合成儀(ABI 433，美國)；高效液相色譜儀(Waters2535，美國)；電噴霧電離質譜(島津，日本)；冷凍干燥機(Christ，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 線性肽的合成

芋螺毒素ImI線性肽(GCCSDPRCAWRC-NH2)的合成參照文獻[12]的方法，采用Fmoc化學方法合成ImI的線性肽，樹脂為Wang Resin，從C端至N端合成，HBTU/HOBt/DIEA縮合形成肽鍵。合成過程中非半胱氨酸的側鏈保護基團如下所示：Ser(tBu)，Asp(OtBu)，Arg(Pbf)，Trp(Boc)。半胱氨酸Cys 1和Cys 3用S-Trityl(Trt)保護基團，Cys 2和Cys 4用S-acetamidomethyl(Acm)保護基團。樹脂肽合成后，按照每20 mg的樹脂肽1mL試劑K(82.5% TFA/5% phenol/5% H2O/5% Thioanisole/2.5% EDT，v/v)切割(室溫2 h)，過濾并用20倍體積的-20 ℃冰乙醚沉淀和洗滌回收線性肽粗品，進行HPLC純化，采用Vydac C18柱：流動相A(水，0.1%TFA)，流動相B(乙腈，0.1%TFA)；流速12 mL/min；60 min線性梯度洗脫，B相20%至80%，檢測波長214 nm。經過HPLC反復純化后獲得線性肽，分析型HPLC分析其純度達95%以上，通過質譜鑒定無誤后，進行凍干保存，用于后續的氧化折疊反應。

1.3.2 兩步法氧化折疊

第一步氧化，將純化后線性肽溶于鐵氰化鉀反應液(K3[Fe(CN)6]10 mmol/L，Tris 0.1 mol/L，pH 7.5)中促使形成第一對二硫鍵(Cys1和Cys3)，線性肽濃度不高于50 mg/mL，室溫氧化折疊45 min。HPLC純化反應后的產物，并進行質譜鑒定。第二步氧化，將純化的產物加入充入氮氣保護的碘(I2)反應液中(7.5 mmol/L I2溶液;水/TFA/乙腈=73∶3∶24，V/V)，反應5～10 min，加抗壞血酸至溶液顏色消失，形成第二對二硫鍵(Cys2和Cys4)得到ImI最終活性產物。采用HPLC對合成的產物純化并進行質譜確認。

1.3.3 MTT法

取對數期生長的Sf9細胞，用細胞計數板計數，按每孔100 μL接種于96 孔板中，每孔細胞數量控制在103個左右，27 ℃培養至細胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的芋螺毒素純品，每組各設置3個復孔，以不加抑制劑的實驗組作對照。27 ℃條件下培養48 h后，每孔加入濃度為5 mg /mL的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)10 μL，繼續培養4 h。棄去板中培養液及MTT，每孔加入100 μL DMSO(二甲基亞砜)，室溫低速震蕩15 min。待結晶物完全溶解后，在酶標免疫測定儀測定490 nm處的吸光度值。

1.3.4 昆蟲注射法

選用3齡或4齡的黃粉蟲(約180 mg/條)，注射前采用雞飼料正常喂食。在實驗當天將芋螺毒素溶解在0.7%鹽水中至所需濃度，使用微注射器(氣相尖頭微量進樣器，10 μL，上海高鴿)進行注射，注射體積為5 μL，用10 μL 0.7%鹽水沖洗導管死腔中殘留藥物。將溶解的芋螺毒素分別以不同濃度注射到黃粉蟲體內(n=10)。用0.7%鹽水溶液注射對照組黃粉蟲(n=10)，每個濃度做三次重復。在48小時觀察注射芋螺毒素或0.7%鹽水的黃粉蟲死亡情況。

1.3.5 數據處理

數據處理和分析采用統計軟件GraphPad Prism6，數據以mean±SD表示，兩組間數據分析比較采用t檢驗。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結果

2.1 線性肽的合成

采用化學方法合成了ImI線性肽，對粗肽進行HPLC純化(見圖 1)。ImI線性肽的洗脫時間為 9.653 min，最終得到純度為95%的線性肽約20.2 mg。

圖1 HPLC純化線性肽ImIFig.1 HPLC Purification of linear peptide ImI

2.2 氧化折疊

利用鐵氰化鉀溶液和I2溶液對合成的線性肽ImI進行兩步法氧化折疊，并對氧化折疊終產物進行HPLC純化和質譜鑒定。樹脂切割后的線性肽分子量為1497.78 Da，符合含有Acm保護基團的ImI分子量。經第一步氧化后的分子量為1495.78 Da，與氧化前相比少了2 Da，證明第一對二硫鍵形成。第二步氧化折疊后質譜鑒定ImI分子量為1351.58 Da，與第一步氧化后的分子量相差144.2 Da，證明第二步氧化折疊是切割兩個Acm保護基團并形成了第二對二硫鍵(如圖2)。再與其線性肽的分子量1355.634 Da 相差約4 Da，亦證明脫去4個氫原子形成了兩對二硫鍵。通過兩步氧化法最終從20.2 mg線性肽ImI中獲得活性產物約9.75 mg，產率為48.3%。

圖2 氧化折疊后ImI的質譜鑒定Fig.2 Identification of oxidative folding ImI by mass spectrometry

2.3 MTT法

通過MTT法測試芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制作用。實驗結果(圖3)表明，與對照組(0.7% NaCl溶液)相比，實驗組均具有顯著性差異。芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制效果具有劑量效應，半數有效量為 0.13 nM。

2.4 昆蟲注射法

不同濃度的芋螺毒素ImI被注射到黃粉蟲的腹部來評價其殺蟲作用。圖4可以看出空白對照和陰性對照組致死率均為0，表明注射法模型對于評價殺蟲作用是可行的。隨著芋螺毒素ImI的注射量的增加，對昆蟲的致死率從16.6%到66.7%，經計算黃粉蟲的半數致死劑量為0.11 μg/mg。

圖3 芋螺毒素ImI對昆蟲細胞sf9的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of conotoxin ImI on growth of insect sf9 cells注：測試組對比于陰性對照組，*表示具有顯著性差異(*P < 0.05,**P < 0.01)。Note:Compared with the negative control group,the test group showed significant difference(*P < 0.05,**P < 0.01).

圖4 芋螺毒素ImI對黃粉蟲的殺蟲作用Fig.4 Insecticidal effects of conotoxin ImI注：測試組對比于陰性對照組，*表示具有顯著性差異(** P < 0.01,***P< 0.001,**** P <0.0001)。Note:the test group was compared with the negative control group and * indicated significant difference(**P < 0.01,*** P<0.001,****P< 0.0001).

3 討論

隨著化學殺蟲劑的普遍使用，農業害蟲的耐藥性不斷增加，導致殺蟲劑毒性和使用量都越來越大，食品安全和環境生態問題頻現，進而嚴重威脅著人類健康[13]。雖然采取了禁用高毒農藥等措施，但也將出現可替代新農藥品種缺乏等諸多問題。因此，對新型、高效、安全的生物殺蟲劑的需求非常迫切。

乙酰膽堿受體(nAChR)是脊椎動物和無脊椎動物神經系統中快速介導膽堿能突觸傳遞的配基門控離子通道[14]。在昆蟲中，nAChR在神經肌肉接頭處沒有分布，卻是中樞神經系統中最豐富的神經遞質受體，因此成為殺蟲劑的作用靶標[15]。John Moon等采用注射法將重組肽Tgu6.1注射到多毛蟲中樞神經索部位，來鑒定殺蟲活性[16]。Monica Mejia等[17]開發一種使用果蠅注射和電生理記錄的篩選芋螺毒素的新方法。芋螺毒素ImI是來源于食蟲帝王芋螺(Conusimperialis)，具有4個半胱氨酸形成2個二硫鍵，其作用靶點為α7-nAChR，我們推測其具有殺蟲活性[18,19]。采用化學方法合成芋螺毒素線性肽，經氧化折疊后質譜鑒定獲得芋螺毒素ImI，采用MTT法和昆蟲注射法研究其殺蟲活性。實驗結果表明芋螺毒素ImI具有抑制昆蟲細胞sf9生長的活性，半數有效量為0.13 nM；對黃粉蟲具有殺蟲活性，半數致死劑量為0.11 μg/mg。

目前認為多肽類毒素發揮殺蟲作用的第一作用靶標為nAChR，但沒有發現其具體作用位點。近年來，對果蠅、桃蚜、煙草天蛾等昆蟲的nAChR進行了分子克隆和功能鑒定，為殺蟲劑作用機理及抗性機制的研究提供分子基礎[20]。多肽類毒素類殺蟲劑作用于昆蟲神經傳導的突觸部位，與乙酰膽堿競爭受體位點，占領受體位點后，抑制神經興奮的傳導，造成昆蟲麻痹，最終死亡[21]。因此，以nAChR作為靶標來研發新型殺蟲劑需要加以重視，搞清楚芋螺毒素如何特異性作用于昆蟲nAChR各種亞基的作用位點，從本質上揭示其殺蟲作用機制，以進行殺蟲劑的合理設計和高通量篩選，創制出新型生物殺蟲劑，提高其在害蟲防治中的應用價值將是進一步需要開展的工作。