新型天麻素衍生物在辣椒堿致大鼠偏頭痛模型中的療效

谷漫峽,王平漢,陳 雛,杜俊蓉*

1四川大學華西藥學院，成都 610041；2四川省中醫(yī)藥科學院，成都 610041

偏頭痛是一種常見的由多種復雜的因素導致的慢性神經(jīng)血管系統(tǒng)紊亂性疾病。偏頭痛發(fā)作具有中重度搏動性特點，常表現(xiàn)為單側(cè)發(fā)作、并伴隨有惡心、嘔吐、畏光、畏聲等中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性癥狀[1]。

天麻素是從天麻塊莖提取的主要活性成分之一，具有抗驚厥、抗癲癇、止痛、鎮(zhèn)靜等藥理學功效。已有研究證實，天麻素能明顯改善偏頭痛患者的發(fā)作頻率和程度[2]。目前，天麻素作為一種主要的神經(jīng)治療藥物已普遍應(yīng)用于臨床。然而由于天麻素的結(jié)構(gòu)限制，不易通過血腦屏障進入腦組織，使其進入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用療效較差[3]。因此，我們合成了阿魏酸與天麻素的酯類衍生物，以提高天麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的作用。其中阿魏酸是治療心腦血管疾病藥品的基本原料，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛等活性。天麻素、天麻素衍生物化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。

辣椒堿是紅辣椒中的一種辛辣成分，具有脂溶性。研究發(fā)現(xiàn)，它可通過與1型瞬時受體電位辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid type 1 receptor，TRPV1)結(jié)合，活化外周和中樞神經(jīng)末梢的三叉痛覺感受傳入神經(jīng)，導致外周初級神經(jīng)元和中樞次級神經(jīng)元的激活，促進疼痛相關(guān)信號的活化以及相關(guān)炎癥因子的釋放，產(chǎn)生中樞和外周的應(yīng)答反應(yīng)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，小腦延髓池內(nèi)滴注辣椒堿能激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(trigeminovascular system，TGVS)進而誘發(fā)偏頭痛樣癥狀[5,6]。

本研究采用小腦延髓池滴注辣椒堿致大鼠偏頭痛模型，來探討新型天麻素衍生物在辣椒堿所致急性偏頭痛中的療效及其作用機制。

圖1 Gas、Gas-D化學結(jié)構(gòu)及其氣相色譜圖Fig.1 Chemical structures and UPLC chromatograms of Gas and Gas-D

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠，體重280～330 g，購自四川省成都市達碩實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(川)2014-189。常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水與攝食。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持 24 ± 1 ℃ ，相對濕度 50% 左右。

1.2 試劑及儀器

辣椒堿(北京百靈威)、Gas(成都曼斯特)、Gas-D(由四川中醫(yī)科學院陳雛副教授制備)(結(jié)構(gòu)如圖1所示)、NO測定試劑盒(南京建成)、CGRP ELISA Kit(武漢優(yōu)爾生)、山羊抗pERK抗體(Santa Cruz)、兔抗c-Fos抗體(北京中杉金橋)、雞抗CGRP抗體(Neuromics)、β-actin(Santa Cruz)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)。。

Varioskan Flash全波長酶標儀(Thermo Fisher)、Gel Pro Analyzer 6.0(Media Cybernetics，美國)、 Gel Doc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、DS-Fi1c 正置熒光顯微鏡(NiKon，Japan)、冰凍切片機(LEICA RM2245，Nussloch,Germany)。

2 方法

2.1 偏頭痛動物模型的建立及給藥

48只大鼠隨機均分為六組：空白對照組、模型組、天麻素組(Gas100、Gas50)及天麻素衍生物組(Gas-D100、Gas-D50)。預防灌胃給藥 1 h，劑量10 ml/kg，空白對照組、模型組給予溶媒。

腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，固定，5 min內(nèi)小腦延髓池內(nèi)注入辣椒堿溶液(100 μL， 10 nmol)，空白對照組給予等量溶媒。隨后將大鼠頭高位30°放置30 min，再俯臥位90 min后處死[6]。

2.2 藥物配制方法

辣椒堿溶液：將辣椒堿溶于10%無水乙醇、10%吐溫80和0.9% NaCl溶液(1∶1∶8)的溶媒中配成5 mM的濃溶液，4 ℃保存，臨用前將其用0.9% NaCl溶液稀釋成0.1 mM，超聲使其充分溶解。

Gas、Gas-D：溶于0.5% CMC-Na溶液中，充分混勻，使其終濃度為100 mg/kg或50 mg/kg的溶液。

2.3 標本處理

造模2 h后，腹腔注射水合氯醛深度麻醉大鼠，頸外靜脈取血。采集血樣后，灌流，取右側(cè)TG、TNC，固定脫水，存于-80 ℃；取腦、TNC及左側(cè)TG液氮速凍后存于-80 ℃。

2.4 NO、CGRP含量測定

血漿和腦組織中NO以及血漿中CGRP的測定參照試劑盒說明書進行。

2.5 c-Fos和pERK免疫組化檢測

固定脫水后的TNC或TG從-80 ℃取出，冰凍切片機中連續(xù)切片。4%多聚甲醛30 min，0.01 M PBS洗片。0.03%Triton 100，37 ℃，1 h，PBS洗片。3%H2O220 min，PBS洗片，高溫高壓抗原修復3 min。BSA封閉1 h。兔抗c-Fos(1∶100)或山羊抗pERK(1∶100)37 ℃，1 h， 4 ℃過夜。PBS洗片。二抗37 ℃，1 h， PBS洗片。SABC 37 ℃，1 h，PBS洗片。 DAB染色1 min，水洗終止。梯度酒精脫水烘干，封片。鏡下采圖，各組切片選取5個相同視野[7]。

2.6 CGRP免疫熒光檢測

TNC從-80 ℃取出，冰凍切片機中連續(xù)切片。4%多聚甲醛30 min，0.01M PBS洗片。0.03% Triton 100 ，37 ℃，1 h,PBS洗片。3%H2O220 min。BSA封閉1 h。雞抗CGRP(1∶100)37 ℃，1 h。4 ℃過夜，PBS洗片。兔抗FITC IgG(1∶100)37 ℃，避光1 h。PBS洗片，抗熒光猝滅劑封片，鏡下采圖。

2.7 免疫印跡檢測TNC中c-Fos、CGRP蛋白以及TG中pERK的表達

取液氮速凍的TG、TNC組織，用RIPA緩沖液提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后采用Western Blot法檢測TNC中c-Fos蛋白的表達。提取的蛋白在凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上[10]。將膜置于5%脫脂牛奶(0.5% TBST配制)中封閉1 h。一抗(兔抗c-Fos抗體1∶500；山羊抗pERK抗體1∶200；雞抗CGRP抗體1∶500)孵育，4 ℃過夜，而后室溫孵育二抗1 h后采用電化學發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。每個波段的光密度值由 Gel Pro Analyzer6.0( Media Cybernetics，美國) 測量分析。

2.8 實驗數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 Gas及Gas-D對NO濃度的影響

結(jié)果如表1，與空白對照組相比，模型組血漿NO濃度顯著升高(P<0.01)；Gas-D(100或50 mg/kg)對辣椒堿誘導產(chǎn)生的血漿NO有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性(P<0.01，P<0.05)；在等劑量下，Gas-D的效果更顯著(Gas-D100 與Gas100相比P<0.01；Gas-D50 與Gas50相比P<0.05)，Gas50對血漿中NO有抑制的趨勢，但與模型組相比不存在顯著性差異(P>0.05)。

Gas-D100與Gas100均能顯著降低腦組織中NO水平，且組間相比無差異。與模型組相比，Gas-D50能有效降低腦組織中NO水平(P<0.05)，而Gas50無此效果(P>0.05)，組間比較存在顯著性(P<0.05)。

表1 各組大鼠血漿及腦組織NO濃度測定結(jié)果Table 1 Results of NO concentration of plasma and brain tissue in tars(n = s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Gas100比較，#P<0.05，##P<0.01；與Gas50比較，△P<0.05，△△P<0.01(下同)。
Note:Compare with model,*P<0.05,**P<0.01;Compare with Gas100,#P<0.05,##P<0.01;Compare with Gas50,△P<0.05,△△P<0.01.(similarly hereinafter).

3.2 Gas及Gas-D對血漿及TNC中CGRP表達水平的影響

表2統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，與空白對照組相比，模型組血漿中CGRP水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D100與Gas100治療組血漿CGRP濃度均顯著降低(P<0.05，P<0.05)。Gas-D50具有降低血漿CGRP水平的趨勢，與模型組比無顯著性差異，而Gas50無抑制作用(P>0.05)。此外在等劑量下，Gas-D較Gas更有效。

與空白對照組比，模型組TNC中CGRP表達水平顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D 100、Gas100及Gas-D50組能顯著抑制辣椒堿所致CGRP表達水平增多(P<0.01，P<0.01，P<0.05)，Gas50有抑制CGRP表達的趨勢，與模型組比無顯著差異(P>0.05)。Gas-D與等劑量的Gas相比對CGRP的抑制作用更顯著。圖2、5分別為IHC和WB法反應(yīng)的各組小鼠TNC中CGRP的表達情況。

表2 各組大鼠血漿及TNC中CGRP表達水平結(jié)果Table 2 The results of CGRP expression in plasma and TNC in rats s)

圖2 各組大鼠TNC中CGRP的表達情況Fig.2 The effects of Gas and Gas-D on CGRP expressions in TNC in capsaicin-induced migraine rats.TNC samples were determined by IF.Representative specimens of CGRP in TNC in different group

3.3 Gas及Gas-D對TNC中c-Fos蛋白表達的影響

圖3、5所示，分別為采用IHC和WB測定TNC組織中c-Fos蛋白表達情況。鏡下陽性細胞散在分布于TNC，呈灰黑色。各組大鼠陽性細胞個數(shù)統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。模型組 c-fos 陽性細胞數(shù)與空白對照組比較顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，Gas-D 100與Gas100組c-Fos蛋白表達顯著降低(P<0.01，P<0.01)，且Gas-D100與Gas100相比對c-Fos蛋白表達抑制作用更顯著(P<0.05)。Gas50無抑制效應(yīng)(P>0.05)，而可顯著抑制c-Fos蛋白表達(P<0.05)，Gas-D50與Gas50相比有顯著差異(P<0.05)。此外Gas-D對c-Fos蛋白表達的抑制呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

3.4 Gas及Gas-D對TG中pERK表達的影響

Gas及Gas-D對TG中pERK表達的影響見圖4、5，其中pERK陽性表達呈深灰色。我們對各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)下頜神經(jīng)分支(V1)處pERK 陽性表達百分率進行統(tǒng)計[6]，結(jié)果見表4。與空白對照組相比，模型組pERK 表達顯著增多(P<0.01)；與模型組相比，Gas-D 100、Gas100及 Gas-D50組均有

組別GroupTNC中c-Fos陽性細胞數(shù)Number of positive c-Fos neurons in TNC (IHC)空白對照 control 14±4.86??模型 model 40±10.15Gas50 35±14.53Gas100 25±4.95??Gas-D50 30±14.74?,△Gas-D10021.5±3.82??,#

圖3 Gas及Gas-D對TNC中c-Fos蛋白表達情況(IHC)Fig.3 The effects of Gas and Gas-D on c-Fos expressions in capsaicin-induced migraine rats.Cross-sections through the TNC were stained dark brown are the activation marker Fos in neuronal nuclei.Representative specimens of immune-staining of c-Fos protein in different group

抑制作用(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。Gas50有抑制pERK表達的趨勢(P>0.05)。Gas-D100和 Gas-D50分別與等劑量的Gas相比，均存在顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠TG中pERK表達水平結(jié)果Table 4 The results of pERK expressions in TG in rats(n = s)

圖4 Gas及Gas-D對TG中pERK表達情況Fig.4 The effects of Gas and Gas-D on the expression of pERK-IR in TG 2 h after capsaicin infusion.Representative specimens of pERK in TG in different group

圖5 Gas及Gas-D對TNC中c-Fos/CGRP以及TG中pERK表達的影響(WB)Fig.5 The results of c-fos protein and CGRP expressions in TNC and pERK in TG(A).The TNC and TG were harvested for WB analysis.The ratio of c-Fos(B)/CGRP(C)/pERK(D) to β-actin was densitometrically analyzed and is expressed as the optical density relative to the model group.The data are expressed as mean ± SD (n = s).*P<0.05,** P<0.01,vs.model group.

4 討論

目前，偏頭痛的發(fā)病機制尚未被完全闡釋清楚，三叉神經(jīng)血管學說較為全面的解釋了偏頭痛的病理生理過程而被廣泛接受[5,6]。該學說認為，偏頭痛的發(fā)作源于三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)TGVS的激活，TGVS將外周痛覺信號通過TG傳導至腦干內(nèi)的TNC并進一步傳至上級痛覺中樞，從而在大腦皮層產(chǎn)生痛覺[8]。目前，偏頭痛動物模型主要為硝酸甘油動物模型，但是該模型僅限于偏頭痛樣癥狀，而不足以說明偏頭痛的神經(jīng)源性炎癥機制[5,9]。研究表明，辣椒堿可強烈興奮A-δ和C纖維初級痛覺感受神經(jīng)元，激活TRPV1并與之結(jié)合，活化外周和中樞神經(jīng)末梢的三叉痛覺感受傳入神經(jīng)，導致外周初級神經(jīng)元和中樞次級神經(jīng)元的激活，進而可以導致TGVS的活化[4-6]。TGVS激活后一方面導致腦膜血管擴張、血漿蛋白滲出、神經(jīng)元激活、血管活性物質(zhì)NO[2]、CGRP[2,7,9]等的釋放，這些產(chǎn)物又通過強烈的擴血管作用，加劇神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)；另一方面導致傷害性疼痛標志物pERK[10]和疼痛相關(guān)信號c-Fos蛋白[5,6,9]表達增多，從而激活下丘腦、腦干及脊髓節(jié)段神經(jīng)，引起三叉神經(jīng)纖維的超敏反應(yīng)，而誘發(fā)頭痛發(fā)作。有研究報道，小腦延髓池注射辣椒堿可誘導大鼠產(chǎn)生急性偏頭痛癥狀[4-6]。因此我們采用辣椒堿所致大鼠急性偏頭痛模型。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，c-Fos參與傷害性感受傳導通路的調(diào)制,常作為神經(jīng)元受刺激后激活的標志物[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿能強烈激活c-Fos蛋白的表達，而在給予天麻素及其衍生物治療后，c-Fos蛋白的表達被顯著抑制，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。pERK是ERK被激活的磷酸化形式，可介導傷害性刺激通路[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，注射辣椒堿的大鼠TG中pERK的表達顯著增多，而天麻素及其衍生物均可有效抑制 pERK的表達。由此推論，Gas、Gas-D能有效抑制TNC中c-Fos蛋白的表達從而減少TNC神經(jīng)元的激活，并能抑制ERK的磷酸化水平而抑制信號傳遞，緩解疼痛刺激，減輕偏頭痛癥狀。

CGRP是目前公認的作用最強的血管擴張肽[2,7]。NO為血管內(nèi)皮細胞舒張因子，可促使血管平滑肌松弛，導致腦膜血管擴張而誘發(fā)頭痛[2,9]。有研究報道，在偏頭痛發(fā)作期，外周血中CGRP 水平增高，且偏頭痛發(fā)作的強度和持續(xù)時間與血中 CGRP 水平呈正相關(guān)[7,9]。本研究結(jié)果顯示，小腦延髓池注射辣椒堿后大鼠血漿和中樞中NO及CGRP的表達較空白對照組顯著升高，NO與CGRP存在共表達的情況。我們推測，二者可能協(xié)同發(fā)揮擴張腦血管的作用，Gas與Gas-D可能是直接消除中樞的NO，隨后產(chǎn)生抑制CGRP表達的效果。

綜上，本項研究表明，Gas-D能有效抑制NO、CGRP的水平從而抑制血管擴張作用；Gas-D可減少TG中pERK和TNC中c-Fos蛋白的表達，從而抑制痛覺信號的傳導，抑制TGVS系統(tǒng)的激活，產(chǎn)生抗偏頭痛作用。