生、制首烏正己烷提取物對維甲酸致小鼠骨質疏松的防治作用

吳曉青，陳曉珍,劉睿穎,任瑤瑤,蔣合眾,譚 睿*

1西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031；2中國科學院成都生物研究所，成都 610041

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根，是著名的生熟異治中藥，有生首烏和制首烏之分。生品性平，味甘、苦；歸心、肝、大腸經；制品性變溫、味轉甘，歸肝、腎經。功善補益精血，固腎烏須。骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少，骨脆性增加以及骨折危險性增高為特征的骨代謝性疾病。原發性OP是絕經后老年婦女的一種常見病、多發病，隨著世界人口老齡化的發展，老年性OP發病率也呈上升趨勢，WHO已將其列為三大老年性疾病之一。

目前臨床上用于治療OP的藥物主要有鈣劑、雌激素、維生素D、降鈣素類、雙磷酸鹽類等，雖然臨床上具有一定的療效，但不良反應較多。中藥治療骨質疏松癥日益受到青睞，但其肝毒性也已引起重視。有些療效確切、臨床用藥廣、關注度高的知名中藥如壯骨關節丸、仙靈骨葆膠囊(《2012版中國國家基本藥物目錄》在列唯一補腎壯骨中成藥)等有肝臟不良反應，且均已在《藥品不良反應信息通報》公開，這對臨床安全、合理用藥帶來極大挑戰。前期我們發現，制首烏無毒[2]。已有研究報道，制何首烏含藥血清能促進成骨細胞增殖[1]，大黃素能促進骨髓基質干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)向成骨細胞方向分化，抑制BMSCs向脂肪細胞方向分化[3]。二苯乙烯苷能促進BMSCs堿性磷酸酶表達，刺激骨鈣素分泌，上調Collal和Runx2 mRNA的表達，增加Wnt信號通路核心蛋白(β-catenin ) mRNA和蛋白的表達[4]。生、制首烏正己烷提取物對維甲酸誘發的骨質疏松是否有作用，未見報道。本實驗通過檢測骨代謝相關生化指標、骨密度、骨顯微結構等探討生、制首烏正己烷提取物對維甲酸致小鼠骨質疏松癥的藥效作用，為生、制首烏正己烷提取物的進一步開發利用和臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

1.1.1 生、制首烏正己烷提取物的制備

稱取生或制首烏粉末100 g，加入500 mL無水乙醇，超聲波振蕩提取1 h,過濾，重復提取二次，合并提取液，減壓回收溶劑至干，加入150 mL蒸餾水懸浮，用正己烷200 mL×3 萃取，合并萃取液，減壓濃縮至干，浸膏用作抗骨質疏松藥效學實驗。

1.1.2 藥物

生、制首烏正己烷提取物。用0.5%羧甲基纖維素水溶液制成混懸，備用;尼爾雌醇片,北京四環制藥有限公司公司生產；維甲酸(retinoic acid,RA)，重慶華邦生化制藥有限公司產品。

1.2 實驗動物

昆明系小鼠，雌雄各半，開始試驗體重32～34 g,購于四川省醫學實驗動物中心SCXK[川] 2008-14，每天接受12 h光照/12 h黑暗，光照周期為8∶00～20∶00，實驗室溫度20±2 ℃，濕度60%，動物可以自行攝取標準飼料和清潔用水，動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。小鼠適性飼養一周后進行實驗。

1.3 分組及給藥方案

取昆明種小鼠，SPF級，180只隨機分組為正常對照組、模型組(維甲酸105 mg·kg-1)，陽性對照組(尼爾雌醇2 mg·kg-1)，生首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，清蒸制首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，黑豆制何首烏正己烷提取物高、低劑量組48、24 mg·kg-1，每組20只，除正常對照組于每日上午灌胃生理鹽水外，其它各組均于每日上午灌服維甲酸105 mg·kg-1,連續灌胃14 d，在造模的同時，陽性對照組及生、制首烏各劑量組給予不同濃度的受試藥，給藥期間隔天稱量體重以調整給藥量，停藥次日，小鼠摘眼球取血，取股骨。

1.4 血清生化及相關激素檢測

血清鈣，ALP，TRAP檢測均按照試劑說明書進行，血清BGP，E2的含量用放免法測定。

1.5 骨組織形態計量學檢測

取股骨用10%的福爾馬林固定。常規石臘包埋，切片，HE染色，光鏡觀察骨組織形態。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 對血液生化指標的影響

與正常組比較，模型組血鈣水平下降，用藥后血清鈣水平升高，生首烏各劑量組與模型組比較無顯著性差異，制首烏各劑量組顯著升高(P<0.05)。模型組s-ALP,s-TRAP顯著升高(P<0.05)，生、制首烏各劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見表1)。

2.2 對骨代謝相關激素水平的影響

模型組小鼠s-BGP水平顯著高于正常組(P<0.05)。生、制首烏各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無統計學差異。與正常組比較，模型組s-E2水平下降，生、制首烏各劑量組使體內s-E2顯著上升(P<0.05)(見表2)。

2.3 病理學形態觀察

從常規病理切片來看，正常組骨皮質完整，較厚，骨髓腔內容物多，骨小梁大小粗細均勻，骨髓數量較多；模型組皮質變薄，骨小梁數量減少較為稀疏，細少，骨髓數量減少。各治療組與模型組比較，骨組織形態均有不同程度的改善，其中豆制首烏高、低劑量組骨皮質顯著增厚，骨骺生長較活躍，骨小梁較為粗大，相互連接，排列整齊；陽性藥組與模型組比較，骨皮質亦有增厚，骨小梁數量多且連接良好。

表1 生、制首烏對血液生化指標的影響Table 1 Effect of Raw and Processed Polygoni Multiflori on Blood Biochemical

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對照組比較3)P<0.01，
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01

表2 生、制首烏對骨代謝相關激素水平的影響Table 2 Effects of raw and Processed Polygoni multiflori on hormones related to bone

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對照組比較3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

2.4 骨組織靜態計量學觀察

骨組織靜態計量學指標觀察表明，模型組小鼠發生了骨質疏松改變，表現在骨小梁數量及形態變化，骨小梁數量比正常組減少約50%，MTPT(平均骨小梁寬度)明顯變窄(P<0.01)，MBCT(平均骨皮質厚度)明顯變薄(P<0.01)。經各給藥組治療后，與模型組比較，上述指標都出現了明顯改善，骨小梁數明顯增加(見表3)。

3 討論

維甲酸是維生素A的衍生物，臨床上主要用于腫瘤的化療和皮膚病的治療，大劑量服用會引發骨密度降低和骨形態結構的改變，進而造成骨質疏松。該反應與雌激素缺乏引起的骨質疏松極為相似，因此常被用作小鼠急性骨質疏松的造模方法[5]。骨代謝指標具有創傷小、快速靈敏的特點，對評價骨的狀態有重要意義。血清堿性磷酸酶(s-ALP)可以部份反映成骨細胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶(s-TRAP)是反應骨吸收的特征性酶[6]。本實驗中，模型組小鼠s-ALP,s-TRAP顯著升高(P<0.05)，生、制首烏各劑量組與模型組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)，結果表明維甲酸可造成高轉換型骨質疏松。生、制首烏正己烷提取物可顯著降低小鼠血清ALP和TRAP的水平，提示生、制首烏正己烷提取物可抑制骨吸，減小骨丟失。BGP是成骨細胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，是反應骨更新情況的一項特異性指標[7]。生、制首烏各劑量組能降低s-BGP水平，但與模型組比較無統計學差異。從實驗所得數據可以看出，模型組小鼠發生了骨質疏松改變，骨小梁數量及形態變化，骨小梁數量比正常組減少約50%，這一現象與臨床上骨質疏松樣癥狀相符[8，9]，經各給藥組治療后，上述指標都出現了明顯改善。

圖1 骨組織病理切片 Fig.1 Bone tissue biopsy注：A 正常組；B 模型組;C 陽性組;D 生首烏高劑量組;E 生首烏中劑量組;F 清蒸制高劑量組;G 清蒸制中劑量組;H 黑豆制高劑量組;I 黑豆制中劑量組 Note: A Normal group；B Model group；C Positive group；D Raw radix polygoni multiflori high dose group；E Raw radix polygoni multiflori middle dose group；F Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；G Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；H Black soya bean high dose group；I Black soya bean middle dose group

表3 生、制首烏對骨組織靜態計量學指標的影響Table 3 Effects of raw and Processed Polygoni Multiflori Recipe on Static Metrology Indexes of Bone

注：與模型組比較1)P<0.05，2)P<0.01，與空白對照組比較3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

中醫理論認為“肝腎同源，乙癸同源，精血同源” 骨骼的生長發育和修復有依賴于精血的營養滋潤，肝腎虧虛則精血無源，無以生精養骨，髓枯筋痰，發為骨屢。發生骨質疏松癥的主要原因是年老體弱、腎氣不足、腎陽虛和腎陰虛、筋骨失養、經絡不通、氣血疲阻，屬本虛標實之疾。制首烏，補肝腎，藥用價值極高。制首烏正己烷提取物能升高維甲酸所致骨質疏松癥小鼠的的骨密度，同時能有效改善骨小梁微結構退化的現象，有效抑制維甲酸所致骨質疏松癥小鼠的高骨轉換狀態，增加鈣吸收率，降低骨吸收，能有效地預防和治療骨質疏松癥，生、制首烏提取物對維甲酸致小鼠骨質疏松的治療作用，其機制可能與減緩雌激素水平降低，抑制骨高轉換有關，但制首烏臨床使用毒性遠小于生首烏，因此可作為治療骨質疏松的有效藥物之一。