抑制催乳素分泌的大麥芽活性成分

張曉娟，徐德平

江南大學食品學院，無錫214122

大麥芽(Barely malt)是禾本科一年生草本植物大麥(Barley)的成熟果實經發芽干燥而得，不但含有供人體基礎代謝所需的蛋白質、脂肪和碳水化合物，還含有對人體有特殊功能的酶類、酚類和黃酮類等生物活性物質，具有健脾消食、促進消化、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種功能[1，2]。乳腺增生是乳腺癌的前奏，其發病機制主要與體內雌激素、孕激素和催乳素的比例失衡有關。其中，催乳素的含量增加是乳腺增生發病的重要原因。

大麥芽作為一種藥食同源的材料，還具有回乳的功能，其回乳是通過抑制PRL分泌來完成的[3，4]，目前認為大麥芽具有抗乳腺增生作用也是通過抑制PRL分泌，但具體功能成分尚未明確。本研究利用多種色譜方法，從大麥芽活性部位分離出四種主要的活性成分，為實現大麥芽抑制PRL分泌和抗乳腺增生作用提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

大麥芽(江蘇農墾大麥芽有限公司)；苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業股份有限公司，批號100802)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號110403)；MCI柱、ODS柱、ODS-A柱(均為天津南開大學化學工廠產品)；無水乙醇、醋酸鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、正丁醇、濃硫酸、茴香醛、乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為去離子水；小鼠催乳素ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

實驗用ICR小鼠(60只，雌性，6周齡，20～25 g)，上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 儀器與設備

RAT-100D雙層玻璃萃取罐(無錫申科儀器有限公司)；SYB106-100型恒流泵(天津市科器高新技術公司)；MP-201型真空泵(鄭州長城科工貿易有限公司)；R-501型旋轉蒸發器(上海申順生物科技有限公司)；W-O升降恒溫油水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)；HSGF254型薄層板(煙臺江友硅膠開發有限公司)；核磁共振儀(Avance 500 MHz，Bruer公司)。

2 實驗方法

2.1 大麥芽不同萃取物的制備

稱取10 kg大麥芽，粉碎，加入100 L雙層玻璃萃取罐中，以料液比1∶8 g/mL加入體積分數75%乙醇溶液，于60 ℃條件下攪拌提取6 h，過濾取出上清液，濾渣再按上述方法提取2次，合并所有清液減壓濃縮。濃縮物按1∶1加入去離子水，超聲至懸濁狀，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓濃縮得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，于冰箱冷凍保存備用。

2.2 不同萃取物對乳腺增生的作用

2.2.1 乳腺增生小鼠模型的建立

參考文獻方法[5,6]并加以改進，正常對照組小鼠肌肉注射生理鹽水 0.1 mL/只，1次/天，連續注射30天。其余小鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，1次/天，連續25天，繼而改用肌肉注射黃體酮注射液5 mg/kg，1 次/天，連續5天。

2.2.2 分組及給藥

ICR小鼠適應性飼養一周后，隨機分成6組(石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、萃余物組、模型組、正常對照組)，每組10只。除正常對照組小鼠外，其余小鼠均建立乳腺增生小鼠模型。

造模完成后，實驗組分別灌胃石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物各500 mg/(kg·d)；正常對照組和模型組分別給予等量蒸餾水，1次/天，連續1個月。

2.2.3 血清激素的測定

采用酶聯免疫分析法，按照小鼠催乳素ELISA試劑盒說明書中的實驗操作流程進行，分別測定各組小鼠血清中PRL的含量。

2.3 乙酸乙酯萃取物的分離

將具有抑制PRL分泌的乙酸乙酯萃取物取出解凍，過濾，上MCI柱，依次用去離子水、體積分數為50%、70%、90%的乙醇進行梯度洗脫，薄層色譜法(TLC)跟蹤檢測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應將具有相同成分的洗脫液合并，分別減壓濃縮得到A(50%)、B(70%)、C(90%)三個部分。

將A、B、C三個部分分別上ODS柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流速20 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法跟蹤檢測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應將具有相同成分的洗脫液合并，分別減壓濃縮得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別反復上ODS-A柱，用乙醇溶劑梯度洗脫，流速6 mL/min，洗脫液用15 mL/管自動收集器收集，TLC法跟蹤檢測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應將具有相同成分的洗脫液合并，直至得到四個純化合物：1、2、3、4。

2.4 結構鑒定

以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標物，將得到的化合物經氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)等光譜數據分析，確定其結構。

2.5 統計分析

3 結果與分析

3.1 大麥芽不同萃取物抗PRL分泌的檢測結果

大麥芽不同萃取物對各組小鼠的血清PRL水平影響如表1所示。

組別Group血清PRL SerumPRL (pg/mL) 正常對照組Control214.06±11.37 ?模型組Model345.75±24.63石油醚組Petroleum ether extract336.24±15.76乙酸乙酯組Ethyl acetate extract243.13±13.84 ? ?正丁醇組n-Butyl alcohol extract296.34±23.75萃余物組Remaining extract351.33±13.47

注：與模型組比較:*P<0.01，**P<0.05。
Note:Compare with Model,*P<0.01，**P<0.05.

由表1的數據可以得出：模型組小鼠的血清PRL水平(P<0.01)明顯高于正常對照組的水平，說明小鼠乳腺增生模型的制備是成功的[4，5]。與模型組比較，乙酸乙酯組小鼠的血清PRL水平明顯降低，差異顯著(P<0.05)。石油醚組、正丁醇組和萃余物組均無顯著變化。結果表明大麥芽乙酸乙酯萃取物具有明顯的抑制PRL分泌的作用，大麥芽石油醚萃取物、正丁醇萃取物和萃余物抑制PRL分泌的作用不明顯。

3.2 大麥芽抗PRL活性成分的結構鑒定

從具有抗PRL活性的乙酸乙酯萃取物中分離到主要的4個化合物，其化學結構分析如下:

化合物1無色脂狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:5.30 (1H,s),3.96 (2H,d,J=3.2 Hz),3.73 (2H,d,J=3.2 Hz),3.66(2H,d,J=2.8 Hz),3.55 (2H,d,J=2.8 Hz),3.13 (3H,s)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:172.8 (C-1),65.4 (C-2),65.1 (C-3),65.7 (C-4),68.2 (C-5),65.9 (C-6),53.1 (C-7)。從以上數據可推導出化合物1為一甘油酯類化合物。與相關文獻[7,8]對比可得化合物1為3-甲基-1-十六烯酸乙酯甘油酯。

化合物2無色脂狀，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:5.41 (1H,s),4.01 (2H,d,J=3.2 Hz),3.75 (2H,d,J=3.2 Hz),3.68 (2H,d,J=2.8 Hz),3.59 (2H,d,J=2.8 Hz),3.21 (3H,s)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:174.6 (C-1),65.9 (C-2),65.7 (C-3),65.4 (C-4),68.2 (C-5),65.1 (C-6),55.2 (C-7)。從以上數據可推導出化合物2為一甘油酯類化合物。與相關文獻[7,8]對比可得化合物2為3-甲基-1-十八烯酸乙酯甘油酯。

化合物3無定形粉未，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO,500 MHz) δ:6.42 (1H,dd,J=11.5,4.0 Hz),5.94 (1H,t,J=13.2 Hz),5.62 (1H,dd,J=7.5,6.0 Hz),5.34 (1H,q,J=8.0 Hz),3.97 (2H,m)；13C NMR (DMSO,125 MHz) δ:174.8 (C-1),70.8 (C-2),138.1 (C-3),128.5 (C-4),34.1 (C-5),123.9 (C-6),130.8 (C-7)。從以上數據可分析并與相關文獻[8,9]對比可得化合物3為3-十七烷酸-環己-1,4-二烯酯。

化合物4無定形粉未，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。1H NMR (DMSO，500 MHz) δ:5.32 (4H,m),3.61 (1H,m),3.44 (2H,q,J=8.0 Hz)；13C NMR (DMSO,125 MHz)δ:172.9 (C-1),65.2 (C-2),33.4 (C-3),129.7 (C-4),127.8 (C-5),34.1 (C-6),127.7 (C-7),129.6 (C-8)。從以上數據可分析并與相關文獻[8-9]對比可得化合物4為1,4-環己二烯-3-十五烷酸甲酯。

圖1 化合物1～4的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-4

4 結論

乳腺增生的發病多是因為雌激素、孕激素和催乳素比例失調，其中，高血催乳素是乳腺增生發病的重要原因。根據傳統醫學和文獻[2]可知，大麥芽醇提物具有抑制PRL分泌的作用是確定的，本研究通過對小鼠血清PRL含量的測定，顯示造模后小鼠體內血清PRL含量明顯高于正常組大鼠。同時，與模型組比較，乙酸乙酯組小鼠的血清PRL水平明顯降低，石油醚組、正丁醇組和萃余物組均無顯著變化，說明大麥芽乙酸乙酯萃取物具有明顯的抑制PRL分泌的作用。

乙酸乙酯萃取物經MCI柱、ODS柱和ODS-A柱分離得到的四個主要化合物，經核磁鑒定分別為3-甲基-1-十六烯酸乙酯甘油酯、3-甲基-1-十八烯酸乙酯甘油酯、3-十七烷酸-環己-1,4-二烯酯、1,4-環己二烯-3-十五烷酸甲酯。這四個化合物中前二個為甘油酯類化合物，后二個為環己二烯類化合物，均是首次從大麥芽具有抑制PRL分泌的活性部位中分離出來的，目前也無文獻報道這些化合物關于抑制PRL分泌的活性。

在我們前期預備實驗中通過TLC比較，發現這些成分在大麥中并未見到，我們推測可能是大麥在發芽過程中產生的活性成分，但至于甘油酯類化合物和環己二烯類化合物哪一個單體或哪一類化合物是抑制PRL分泌的有效成分，還需要我們進一步研究。