兩種柳珊瑚Anthogorgia caerulea和Menella kanisa的化學成分及其抗海洋污損生物附著活性研究

蘇志維，易湘茜，鄧家剛，郝二偉，侯小濤，米順利，高程海

廣西中醫藥大學海洋藥物研究院 廣西中藥藥效研究重點實驗室 廣西北部灣海洋中藥應用技術與產品研發實驗室，南寧 530200

近年來，海洋污損生物所造成的損失越來越嚴重，全球每年由海洋生物污損所造成的經濟損失高達近百億美元[1]。基于防污劑制成防污涂料是現行最經濟可行的手段。曾經有機錫和氧化亞銅涂料是最有效的防污涂料，但是由于不易降解和三致效應造成不良生態環境影響已被國際海事組織(IMO)禁止使用。因此，當前迫切需要開發安全低毒且具選擇性的環境友好型抗污損劑以取代傳統的防污涂料。在海洋抗污損方面，海洋天然產物防污劑以其易降解、無毒、高效的優勢倍受科研人員關注。目前，已從多種海洋動植物中獲得了一系列如甾類、萜類、肽類、生物堿類等具有抗海洋生物污損附著活性的海洋天然產物[2]。

柳珊瑚中蘊含著豐富的化學成分，至今為止已發現超過800個新化合物，其中不乏抗污損活性成分[3-5]。我國北部灣海域蘊藏著豐富的柳珊瑚資源[6-8],為了充分利用我國豐富的資源，進一步尋找新的抗污損活性成分，本文對北部灣兩種柳珊瑚的次生代謝產物進行了研究，并測試其抗海洋污損生物附著能力，從中發現了一個新的神經酰胺類抗污損成分。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BruckerAvance 600 型核磁共振波譜儀，TMS 為內標；waters 2695(PDA 檢測器，10 mm × 250 mm，5 um，Phenomenex)；N-1100 型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；薄層色譜硅膠與柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；SephadexLH-20(Pharmacia Biotech．Sweden)；高效液相色譜用試劑為色譜純(德國MERCK公司)，顯色劑：5%硫酸乙醇溶液及5%磷鉬酸乙醇溶液、其他常規試劑均為分析純(廣東光華科技股份有限公司)。

1.2 生物材料

采自廣西潿洲島海域的兩種柳珊瑚，由中國科學院南海海洋研究所李秀寶博士鑒定為花柳珊瑚Anthogorgiacaerulea和小月柳珊瑚Menellakanisa，該標本現存放于廣西中醫藥大學廣西海洋藥物研究院(樣品編號分別為2010-GXAS-003和2010-GXAS-004)。

1.3 抗污損生物幼蟲附著活性篩選

1.3.1 幼蟲的培養

藤壺(Barnacleamphitrite)成蟲采自廣西欽州港中石化碼頭的柱樁上，根據Thiyagarajan等[9]方法培養，獲取藤壺無節幼蟲后在28 ℃下用硅藻ChaetocerosgracilisSchutt喂養，在附著測試之前，處于介蟲狀態的藤壺幼蟲在8 ℃黑暗環境中放置 4 d。

1.3.2 抗幼蟲附著活性篩選

該方法參照本實驗室的操作方法進行[10]，將化合物1-7分別溶解于 DMSO 溶液中，用無菌海水配制成 100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.57 μg /mL 共7個濃度梯度。在 24 孔板的每個孔中加入 1 mL 配制好的測試樣品(采用 DMSO 溶解)和15±5個游動藤壺幼蟲，每個樣品做 4 個平行，加含有 1 mL DMSO 的無菌海水作為陰性對照。配有測試樣品的 24 孔板放于培養箱中，培養溫度為 28 ℃，避光放置 24 h 后，觀察實驗結果。通過顯微鏡觀察逐個記錄已附著在板壁上的幼蟲個數和沒有附著在板壁上的幼蟲個數以及已死亡的幼蟲個數。統計已附著在板壁上的幼蟲個數占實驗用總幼蟲個數的百分比，通過 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5 軟件計算受測化合物的 EC50和 LC50。

1.4 提取與分離

小月柳珊瑚Menellakanisa樣品(濕重約為3.08 kg)砍碎，用乙醇-二氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶劑浸泡三次，每次一周，將所得粗提物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，減壓回收試劑，得乙酸乙酯萃取物7.21 g，正丁醇萃取物18.59 g。

將乙酸乙酯萃取物裝柱裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-Me2CO系統(CHCl3∶Me2CO=1∶0.1～1∶0.8/V∶V)和CHCl3-MeOH系統(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據TLC法檢測結果，將成分相近的流份進行合并為11個組分C1-C11。組份C6(455mg)經半制備高效液相色譜進行分離，獲得新化合物1(5.3mg)。

將正丁醇萃取物裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-MeOH系統(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據TLC法檢測結果，將成分相近的流份進行合并為8個組分D1-D8。組份D4(169 mg)經半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物2(9 mg)，組分D6(446.1 mg)先經Sephadex LH-20凝膠柱(CHCl3∶MeOH =1∶1/V∶V)分離后得流份d1～d7，d7再經半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物3(3.3 mg)，化合物4(0.7mg)。

柳珊瑚Anthogorgiacaerulea(濕重約5.0 kg)切碎，用乙醇-二氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶劑浸泡三次，每次一周，將所得粗提物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，減壓回收試劑，得乙酸乙酯萃取物24.82 g，正丁醇萃取物16.28 g。

將乙酸乙酯萃取物裝入正相硅膠柱層析，采用CHCl3-Me2CO系統(CHCl3∶Me2CO=1∶0.1～1∶0.8)和CHCl3-MeOH系統(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～ 0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據TLC法檢測結果，將成分相近的流份進行合并，初步分為8個組分J1-J8。組份J7(254.1 mg)先用HPLC分析柱確定分離條件，再用HPLC半制備柱進行分離純化，在梯度MeOH∶H2O=90∶10/V∶V處，獲得化合物5(1.1 mg)。

將正丁醇萃取物裝入硅膠柱層析，采用CHCl3-MeOH系統(CHCl3∶MeOH=1∶0.1～0∶1/V∶V)依次梯度洗脫，根據TLC法檢測結果，將成分相近的流份進行合并，初步分為6個組分K1-K6。組份K4(385.6mg)經HPLC半制備柱進行分離純化，獲得化合物6(1.2 mg)，組份K5(72.7 mg)經半制備高效液相色譜進行分離，獲得化合物7(1.9 mg)。

2 結構鑒定

由13C NMR、DEPT譜及高分辨質譜m/z536.503 9[M+H]+，(calcd for C34H66NO3,536.503 7，m/z558.486 0[M+Na]+，(calcd for C34H65NO3Na，558.486 2)可以確定其分子是為C34H65NO3(不飽和度為3)。1H NMR譜中δH6.26(1H，brs，H-N)處有酰胺的N-H的特征吸收峰，在低場區存在4個烯質子信號：δH5.78(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-4′)，5.56(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-3′)，5.41(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-7′)，5.38(1H，dt，J=15.5，6.6 Hz，H-6′)；三個連氧質子信號：δH4.32 (1H，m，H-2′)，3.95(1H，dd，J=11.3，3.6 Hz，Ha-1′′)，3.69(1H，dd，J=11.3，3.6 Hz， Hb-1′′)；一個連氮質子：3.90(1H， m， H-1′)；在高場區有5個亞甲基質子信號：δH2.23 (2H，t，J=7.7 Hz，H-2)，2.13(2H，q，J=7.2，6.7 Hz，H-6)，2.07(2H，q，J=7.2， 6.7 Hz，H-7)，1.96(2H，q，J=7.0，Hz，H-10)，1.63(2H，m，H-3)；19個無支鏈脂肪鏈質子信號：δH1.34-1.24 (38H， m， H-4， 5， 8， 9， 11～15， 5′， 8′～16′)；以及兩個端甲基質子信號：0.87 (6H， t，J=6.6 Hz， H-17′及H-16)，這表明了此化合物有可能為神經酰胺類化合物。根據1H NMR、13C NMR和DEPT及HSQC譜對化合物1的C、H分別進行相應的歸屬(見表1)，低場區δC174.1 (C-1)表明是一個酰胺基，同時給出4個烯碳信號：δC133.7 (C-4′)， 131.5 (C-3′)， 129.3 (C-7′)， 129.1 (C-6′)，2個連氧碳信號：δC74.8 (C-2′)， 62.6 (C-1′′)，以及1個連氮碳信號：δC54.56 (C-1′)。以上信號提示化合物1與N-(1-羥甲基-2-羥基)4， 8-二烯-十七烷基-十六脂肪酸酰胺結構非常相近[11]。仔細比較其NMR數據，發現化合物1的C-6′， 7′的化學位移130.6 (C-7′)， 130.4 (C-6′)向低場移，表明雙鍵位置在C-6′， 7′位。這一推論也被觀測到的H-3′/C-2′，C-4′，H-4′/C-2′，C-6′，H-5′/C-4′，C-6′，H-7′/C-6′，H-8′/C-6′的HMBC相關所證實。1H-1H COSY圖譜的信號可以進一步證實分別存在-CH2-(CH2)13-CH3及-CH-(CH)4-CH2-(CH)2-(CH2)9-CH3兩個結構片段單獨的自旋系統。在NOE圖譜中，H-3′分別H-2′， 1′， 5′有相關信號，H-7′與H-5′，9′有相關信號說明C-3′， 4′，C-6′， 7′構成的雙鍵均為反式的，同時H-2和H-1′′的NOESY有相關，表示它們位于同側，說明1′-CH2OH和2′-OH為R構型。在上述分析的基礎上，確定化合物1的結構為N-(1-羥甲基-2-羥基) 3， 6-二烯-十七烷基-十六脂肪酸酰胺(N-[(1-hydroxymethyl)-2-hydroxy-3，6-heptadecadienyl]-hexadecanamide)。化合物1的核磁數據及相關詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1～7的結構Fig.1 Structures of compounds 1-7

圖2 化合物1的1H-1H COSY、NOESY及HMBC主要相關信號Fig.2 Key correlations of 1H-1H COSY、NOESY and HMBC for Compound 1

表1 化合物1的1H、13C譜及1H-1H COSY和HMBC的主要相關信號Table 1 1H,13C NMR data and key 1H-1H COSY,HMBC correlations of 1

化合物2黃色粉末,溶于甲醇;C14H18O4， ESI-MS:m/z251 [M+H]+；1H NMR (600 MHz，MeOD)δH：7.73 (2H， dd，J=6.0，3.6 Hz，H-3，6)，7.62(2H，dd，J=6.0， 3.6 Hz，H-4，5)，4.07(2H，t，J=6.6 Hz，H-1′，1′′)，2.01(2H，m，H-2′，2′′)，0.99(6H， t，J=6.6 Hz，H-3′，3′′)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：166.8(CO)，131.9(C-1，2)， 130.4(C-4，5)，129.3(C-3，6)，64.9(C-1′，1′′)，31.3(C-2′，2′′)，19.3(C-3′，3′′)。化合物2核磁數據與文獻[12]所報道的鄰苯二甲酸二丙酯的核磁數據基本一致，因此該化合物被鑒定為鄰苯二甲酸二丙酯(Dipropyl phthalate)

化合物3無色結晶,溶于甲醇;C14H14O，ESI-MS:m/z199 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，MeOD)δH：7.45(2H，m，H-3′′，5′′)，7.40(2H，m，H-2′′，6′′)，7.34 (1H， d，J= 7.8 Hz，H-4′′)，7.28(1H，t，J= 1.8 Hz，H-5)，7.27(1H，t，J= 2.4 Hz，H-6)，7.16(2H，m，H-2，4)，3.16(4H，m，H-1′，2′)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：156.8(C-1)，143.9 (C-3)，143.1(C-1′′)，136.6(C-5)，133.6(C-3′′，5′′)，131.0(C-2′′，6′′)，129.4(C-4′′)，128.9(C-4)，127.0(C-2)，121.5(C-6)，40.7(C-1′)，33.3(C-2′)。化合物3核磁數據與文獻[13]所報道的3-(2-苯乙基)苯酚的核磁數據基本一致，因此該化合物被鑒定為3-(2-苯乙基)苯酚(3-(2-phenylethyl) Phenol)。

化合物4無色結晶,溶于甲醇;C9H10O3， ESI-MS:m/z166 [M]+；1H NMR(600 MHz，MeOD)δH：7.07(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.71(2H，m，H-3，5)，3.66(3H，s，4-OCH3)， 3.53(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，MeOD)δC：173.3(CO)，156.3(C-4)，130.0(C-2，6)，125.0(C-1)，115.0(C-3，5)，55.2(4-OCH3)，51.1(OCH3)。化合物4核磁數據與文獻[14]所報道的對甲氧基苯甲酸甲酯的核磁數據基本一致，因此該化合物被鑒定為對甲氧基苯甲酸甲酯 (Methyl ester ofp-methoxybenzoicacid)。

化合物5黃色粉末,溶于氯仿;分子式 C20H30O4，ESI-MS:m/z335 [M+H]+；1H NMR (600 MHz，CDCl3)δH：8.19(2H，dd，J=5.6，3.6Hz，H-3，6)，7.71(2H，dd，J=5.6， 3.6Hz， H-4，5)，4.22(4H，m，H-1′，1′′)，1.68(4H，m，H-2′，2′′)，1.31(8H，m，H-3′，4′，3′′，4′)，1.25(10H，m，H-5′，5′′)，0.91(6H，m，H-6′，6′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δC：167.1(CO)，133.5(C-4，5)，131.6(C-1，2)，127.5(C-3，6)，65.4(C-1′，1′′)，32.6(C-2′，2′′)，31.2(C-4′，4′′)，29.7(C-3′，3′′)，24.5(C-5′，5′′)，15.0(C-6′，6′′)。化合物5核磁數據與文獻[15]所報道的鄰苯二甲酸二己酯基本一致，因此該化合物被鑒定為鄰苯二甲酸二己酯(Dihexyl phthalate)。

化合物6淡黃色粉末,溶于DMSO;分子式C14H20O8，ESI-MS:m/z317.22 [M+H]+;1H NMR(600 MHz，DMSO)δH：7.03(2H，J=9.0 Hz，H-3，5)，6.96(2H，d，J=9.0 Hz， H-2，6)，4.17(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′′)，4.06(1H，s，H-5′′)，3.90-3.78(2H，m，H-2′′， 3′′)，3.61-3.45(4H，m，H-4′′，5′′，6′′)，3.05(2H，m，H-2′)，1.90(2H，m，H-1′);13C NMR(150 MHz，DMSO)δC：185.5(C-1)，153.5(C-3，5)，126.5(C-2，6)，102.9(C-1′′)，76.9(C-5′′)，76.8(C-2′′)，73.5(C-4′′)，70.1(C-4)，67.5(C-2′)，64.0 (C-6′′)，42.2(C-1′)。化合物6核磁數據與文獻[16]所報道的梾木甙的核磁數據基本一致，因此該化合物被鑒定為梾木甙(Cornoside)

化合物7白色粉末,溶于DMSO;分子式C10H12N4O5，ESI-MS:m/z269 M+H]+；1H NMR (600 MHz，DMSO)δH：8.29(1H，s，H-2)，8.04(1H，s，H-8)，5.85(1H，d，J=6.0， H-1′)，5.25(1H，m，3′-OH)，4.49(1H，s，H-2′)，4.11(1H，m，H-3′)，3.94(1H，m， H-4′)，3.65(1H，m，H-5′)；13C NMR(150 MHz，DMSO)δC：156.3(C-6)，148.3(C-4)， 146.9(C-8)，138.7(C-2)，124.5(C-5)，87.6(C-1′)，85.8(C-4′)，74.1(C-2′)，70.4(C-3′)，61.4(C-5′)。化合物7核磁數據與文獻[17]所報道的肌苷的核磁數據基本一致，因此該化合物被鑒定為次黃嘌呤核苷(Inosine)。

3 抗污損生物附著活性研究

通過測試兩種柳珊瑚中的化學成分1～7抗藤壺幼蟲附著活性發現，除化合物3，7外均表現潛在的抗海洋污損生物藤壺幼蟲附著活性，其EC50值均低于25 μg/mL(美國海軍研究中心認定能做海洋抗污損劑最低標準)，且LC50(半數致死濃度)也均高于 100 μg/mL (表2)。

表2化合物1～7的抗藤壺幼蟲附著活性
Table 2 Anti-larval settlement activity of compounds1-7againstB.amphitrite

化合物CompoundEC50(μg/mL)LC50(μg/mL)18.72±0.72>100212.34±0.75>1003NAND415.33±0.83>100518.74±1.14>20066.89±1.22>1007NA>100

注：NA表示其EC50大于25 μg mL-1，無抗污損活性，ND表示由于化合物質量太少或溶解度太小無法測試。
Note:NA indicated the EC50is more than 25 μg mL-1,no anti fouling activity,ND indicated the compound quality or solubility is too low to carry out the experiment.

4 結論

通過現代各種分離鑒定方法，從北部灣兩種柳珊瑚Anthogorgiacaerulea和Menellakanisa提取物中共分離鑒定了7個化合物，并采用典型海洋污損生物藤壺的幼蟲篩選模型，測試了化合物1～7的抗海洋污損生物附著能力，發現除化合物3，7外均顯示出具有開發成海洋抗污劑的潛力(EC50< 25 μg /mL)，其中以化合物6的活性最好，新化合物1的活性次之，其抗藤壺幼蟲附著EC50分別為6.89，8.72 μg/mL。