瑞香素及噁唑類小分子抑制吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO1)的研究

李 晟，李焱鑫，Emmanuel Mfotie Njoya，蔣 黎，李 霖*，王 飛*

1中國科學院成都生物研究所天然產物及臨床轉化重點實驗室，成都 610041； 2四川省醫學科學院 四川省人民醫院檢驗醫學研究所，成都 610072

吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是廣泛分布于肝臟以外，含亞鐵血紅素的單體蛋白質，能夠催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑(kynurenine pathway，KP)代謝的限速酶，可催化色氨酸分解產生L-犬尿氨酸、喹啉酸等具有生物活性的代謝產物[1]。IDO1由IDO1基因編碼，IDO1基因啟動子含有2個IFN-γ激活位點[2]，IFN-γ可以誘導IDO1高水平表達。有研究表明，IDO1在多數組織中處于沉默狀態，但是在多種腫瘤細胞中高表達[3]，IDO1的過表達與癌癥的發展和預后相關[4]，抑制IDO1活性在腫瘤疾病的治療中有著舉足輕重的作用，因此IDO1也被認為是一個具有極大開發潛力的靶標。

目前，已經進入抗腫瘤臨床試驗的IDO抑制劑主要包括INCB024360、NLG-919、1-甲基-色氨酸等[5]，但是現有抑制劑存在活性低、選擇性差、分子骨架單一或毒副作用等缺點[6]，世界上還未有IDO1抑制劑藥物問世。作為免疫治療的熱門靶點，IDO1抑制劑的類型和數量都處于一個很低的水平，IDO1及其抑制劑仍然有巨大的研究價值和應用前景。

瑞香素(Daphnetin)是從瑞香屬植物長白瑞香(Daphne Korean Nakai)中提取出來的有效成分，又名祖師麻甲素，其為我國首創的新藥，化學名為7,8-二羥基香豆素(7,8-dithydroxycoumarin)，為香豆素類化合物，主要存在于瑞香科屬植物中。臨床上瑞香素主要用于血栓閉塞性脈管炎、冠心病心絞痛、類風濕性關節炎等疾病[7]。近年來的研究發現，瑞香素也具有抗腫瘤作用[8]，但是其作用機制有待進一步的研究。另外，噁唑類小分子在天然產物和有機合成化合物中廣泛存在，具有該基團的小分子表現出一系列重要的生物活性，包括抗腫瘤、抗真菌、抗炎和抗病毒等，受到了學界和業界的廣泛關注[9]，但是該類化合物發揮其活性的作用靶點和機制還尚不清楚。本研究參考文獻[10]報道的檢測IDO1代謝色氨酸吸光光度法，利用HeLa細胞建立體外篩選IDO1小分子抑制劑模型，并通過過表達IDO1和Western blot等方法，評價篩選到的小分子化合物IDO1抑制活性。實驗結果首次發現了瑞香素和ZH-26具有抑制IDO1的活性，不但為了解瑞香素這一天然來源臨床藥物的抗腫瘤機制提供新的視角，也為開發新的靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物奠定了基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞和質粒

人宮頸癌細胞HeLa、人胚腎細胞HEK-293A購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心，由中國科學院成都生物研究所天然產物中心實驗室保存；IDO cDNA購自北京義翹神州科技有限公司。

1.2 試劑

瑞香素(Daphnetin)購自上海源葉生物科技有限公司；Epacadostat購自上海藍木化工有限公司；人干擾素IFN-γ購自南京金斯瑞生物科技有限公司；IDO1兔多抗、GAPDH兔多抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；轉染試劑LIPOFECTAMINE 2000購自賽默飛世爾科技公司；EasySeeWestern Blot Kit發光液購自北京全式金生物技術有限公司；增強型CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 試劑

Verioskan Flash多功能讀數儀(Thermo Fisher)；ImageQuantLAS500一體化成像儀(GE Healthcare)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

人宮頸癌細胞HeLa、人胚腎細胞HEK-293A均在DMEM-高糖培養基(10%新生牛血清，100 U/mL氨芐青霉素及100 mg/mL鏈霉素)，5% CO2，37 ℃細胞培養箱中培養。

2.2 IDO1抑制劑篩選

HeLa細胞按1.0×105個/孔接種至48孔板，37 ℃培養過夜。每孔加入適量待測試藥物，Epacadostat作為陽性對照藥，培養24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培養24 h以誘導細胞內IDO產生。取100 μL細胞培養液至離心管中，加入25 μL 30%的TCA，50 ℃水浴30 min，10 000 rpm離心10 min，取100 μL上清液至96孔板中，每孔加入100 μL 2%的對二甲氨基苯甲醛(PDAB)，混勻后室溫靜置10 min，多功能讀數儀檢測A492。

2.3 免疫印跡分析

HeLa細胞按1.0×106個/孔接種至6孔板，37 ℃培養過夜。每孔加入不同濃度瑞香素或ZH-26，Epacadostat作為陽性對照藥，培養24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培養24 h以誘導細胞內IDO產生。吸去培養基，PBS漂洗細胞3次，加入適量RIPA裂解液，冰浴30 min裂解細胞，用細胞刮刀將細胞刮下，12 000 rpm離心，收集上清液為蛋白提取液。加入5×loading buffer沸水浴5 min，制得蛋白樣品。12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，用半干法將蛋白轉印至NC膜。轉膜結束后，放入TBST配置的5% BSA中封閉2 h。封閉后膜與一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，用TBST漂洗3次，與HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)在室溫孵育2 h后，TBST漂洗3次，按照EasySee Western Blot Kit發光液說明書進行顯色，通過GE Health成像系統進行成像。

2.4 HEK-293A過表達IDO

HEK-293A細胞按1.0×106個/孔接種至6孔板，37 ℃培養過夜。在轉染前2 h將培養液更換為無血清無雙抗培養液。用125 μLOpti-MEM稀釋2.5 μg IDO cDNA，另用125 μL Opti-MEM稀釋5 μL LIPOFECTAMINE2000，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將質粒稀釋液滴加至稀釋好的轉染試劑中，室溫靜置20 min，將混合液滴加至6孔板中，37 ℃培養6 h更換為完全培養基，37 ℃繼續培養24 h過表達IDO。

2.5 HeLa細胞增殖

HeLa細胞按5 000個/孔接種至96孔板，37 ℃培養過夜。加入不同濃度瑞香素或ZH-26，培養24 h，每孔加入10%增強型CCK-8溶液，在37 ℃繼續培養0.5～1 h。當培養液顏色變黃時，多功能讀數儀檢測450 nm吸光度。

2.6 數據統計與處理

所有實驗均重復三遍，結果表示為平均值±標準差，運用GraphPad Prism軟件進行單因素方差分析(One way-ANOVA)，P<0.05為具有顯著性差異。

3 實驗結果

3.1 IDO1抑制劑篩選

通過以上建立的基于IFN-γ誘導HeLa細胞高表達IDO1模型，對本實驗室771個化合物進行篩選，發現化合物瑞香素和ZH-26(圖1)具有顯著的IDO1活性抑制作用。

圖1 化合物瑞香素和ZH-26的化學結構Fig.1 Chemical structures of daphnetin and ZH-26

用不同濃度的瑞香素和ZH-26檢測對IFN-γ誘導的HeLa細胞表達IDO1酶抑制作用，采用GraphPad Prism軟件對IC50值進行計算，結果如圖2所示。其中瑞香素的IC50值為16.50 ± 0.33 μM，ZH-26的IC50值為4.68 ± 0.21 μM，說明這兩個化合物在體外具有良好的IDO1酶抑制作用。

圖2 瑞香素和ZH-26對IFN-γ誘導的HeLa細胞表達IDO1酶抑制的IC50值Fig.2 The IC50 value of daphnetin and ZH-26 inhibiting the expression of IDO1 in HeLa cells induced by IFN-γ

3.2 HEK-293A過表達IDO1

IDO1在腫瘤細胞中高表達，而在多數細胞之中處于沉默狀態。在HEK-293A中過表達IDO1，檢測瑞香素和ZH-26對IDO1酶的抑制作用。pCMV3-IDO1質粒轉染至HEK-293A細胞24 h后，加入不同濃度的瑞香素和ZH-26處理6 h，細胞上清液檢測IDO1活性，結果如圖3所示，瑞香素和ZH-26均能夠抑制過表達的IDO1酶活性，并且隨著濃度增加該抑制作用加強。以上結果表明，瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性。

3.3 IDO1的免疫印跡

不同濃度的瑞香素和ZH-26處理HeLa細胞，Western blot檢測IDO1蛋白的表達情況，結果如圖4所示。50 ng/mL的IFN-γ可以促進IDO1蛋白顯著表達，而瑞香素可以明顯地抑制IFN-γ上調IDO1的作用，并且隨著化合物濃度的增加，抑制作用越明顯，但是ZH26則對IDO1的表達沒明顯的作用。以上結果表明，瑞香素抑制IDO1活性很有可能是通過下調IDO1的表達。

3.4 HeLa細胞增殖

為了排除化合物對HeLa細胞中IDO1的抑制活性是由于其細胞毒所導致，我們進一步分別用不同濃度的瑞香素和ZH-26處理HeLa細胞24 h，CCK-8檢測化合物對HeLa細胞增殖的影響，結果如圖5所示。在低濃度下，瑞香素和ZH-26對HeLa細胞均沒有明顯的細胞毒作用，表明在低濃度的條件下，化合物下調HeLa細胞的IDO1的表達并不是因為對細胞的毒性作用引起的。

圖3 瑞香素和ZH-26在過表達細胞中抑制IDO1活性Fig.3 Daphnetin and ZH-26 inhibit IDO1activity in overexpressed cells

圖4 瑞香素和ZH-26下調IDO1表達Fig.4 Daphnetin and ZH-26 down regulated the IDO1 expression

圖5 瑞香素和ZH-26對HeLa細胞的增殖作用Fig.5 Inhibition of cell proliferation by daphnetin and ZH-26 in HeLa cells

4 結論

由于IDO1在腫瘤的發生轉移以及腫瘤免疫耐受過程起到重要的作用，IDO1被證實是抑制惡性腫瘤形成，提高免疫治療效果的重要靶點[11]，同時IDO1也與阿茲海默病、抑郁癥等多種疾病的發病機制密切相關[12]，因此IDO1抑制劑的開發具有十分廣闊的前景。

目前，已有大量關于IDO1抑制劑的相關報道，部分抑制劑進入了臨床研究階段，但仍存在活性低、選擇性差、分子骨架單一或毒副作用等缺點。1-甲基色氨酸(1-MT)是一個以色氨酸為模板化學合成的IDO1競爭性抑制劑，其對IDO1的抑制活性并不高(Ki = 19～35 μM)[13]。INCB024360也是臨床中運用的測試藥，細胞測試其對IDO1的IC50為7.1 nM，不能抑制吲哚胺2，3-雙加氧酶-2(Indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2)和色氨酸雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)，但是INCB024360治療癌癥的同時也帶來不小的毒副作用。天然產物是藥物篩選的寶庫，也是重要來源之一，針對天然產物的IDO1抑制劑篩選報道中，色胺酮的衍生物對IDO1有抑制活性(Ki50= 180 μM)[14]。基于熒光素酶報告基因篩選得到的川楝素(Toosendanin)可以下調IFN-γ誘導的腫瘤細胞IDO1表達，促進NK細胞對A549細胞的殺傷作用[15]。槲皮素(Quercetin)可能通過抑制IDO1活性，影響色氨酸代謝發揮抗腫瘤作用[16]。

促炎因子IFN-γ能夠誘導HeLa細胞表達大量的內源性IDO，因而在細胞上清中可以檢測到犬尿氨酸的含量變化。在HeLa細胞中，IFN-γ只能誘導IDO1的表達，不能誘導IDO2或TDO的表達[16]。以此建立了IDO1小分子抑制劑體外篩選模型，并在實驗室化合物庫中得到了天然小分子瑞香素和ZH-26兩個具有潛在抑制IDO1活性的化合物[17]。其中，ZH-26與靶向基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)進入臨床 I 期研究的抗腫瘤轉移藥物CGS 27023A的結構類似[18]。

本研究首次發現瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性，從而為基于香豆素類和噁唑類結構開展新型IDO1抑制劑的藥物設計提供了藥物前體，也為進一步了解其生物活性機制提供了新的思路。瑞香素過去也被發現是一種蛋白酶抑制劑，能夠抑制EGFR、PKA和PKC[19]。因此，瑞香素可能通過抑制EGFR等蛋白激酶進而影響干擾素介導的JAK/STAT信號傳導及IDO1表達。本研究發現瑞香素和ZH-26是新型高效的IDO1抑制劑，在體外可以下調IFN-γ誘導的IDO1表達或抑制IDO1的活性，不但為了解瑞香素這一臨床藥物的抗腫瘤機制提供新的視角，也為開發新的靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物奠定了基礎。