3D打印多孔材料應用于骨缺損修復的研究進展*

王進 葛建飛** 郭開今 鄭欣

（1.蘇州大學附屬張家港醫院骨科，江蘇蘇州 215600；2.徐州醫科大學附屬醫院骨科，江蘇徐州 221002）

3D 打印技術是一項新型數字化快速成型技術，也稱為增材制造技術，它是在計算機輔助下，以物體的計算機輔助設計（computer aided design,CAD）模型或CT掃描等數據為基礎，利用金屬粉末、陶瓷等原材料，通過“分層制造、逐層疊加”的方式快速構造任意復雜結構的物理模型[1,2]。骨科較常用的3D打印技術主要包括光固化立體打印、選擇性激光燒結、熔融沉積成型、金屬直接熔融、噴墨打印等[3]。

由高能量創傷、骨腫瘤切除、骨髓炎清創等原因造成的大段骨缺損，如何修復一直是臨床醫師面臨的巨大難題。傳統治療技術存在諸多弊端：自體骨移植被視為修復骨缺損的“金標準”，但其取材有限，需進行額外手術取骨而造成取骨區出血、疼痛、感染等并發癥；同種異體骨移植存在傳播疾病、誘發免疫反應、骨愈合不良等缺陷[4,5]。近年來，隨著材料學、工程學、生命科學的快速發展，骨組織工程支架材料用于骨缺損修復的研究受到廣泛關注。傳統制備工藝加工的多孔支架材料內部孔隙結構不可控、外形與宿主骨缺損不完全匹配，很難滿足實際需求[6]。利用3D打印技術制備的多孔支架材料不僅可以構建與缺損骨組織相匹配的復雜外形，還可以精確調控內部孔隙結構，同時可攜帶生物活性因子及細胞進行骨缺損部位的原位打印，從而獲得理想的骨修復效果[3,7,8]。本文就3D 打印技術制備的不同骨缺損修復多孔支架材料的研究進展作一綜述。

1 常見的3D打印多孔材料

1.1 金屬材料

金屬因其良好的生物相容性、較強的耐疲勞性及優異的力學性能而被廣泛應用于骨組織工程，目前常見的金屬支架材料包括鈦及其合金、鈷、鎳合金、不銹鋼等。金屬熔融溫度較高，支架材料3D打印需要特定的高溫條件，無法同步涂層生物活性因子或細胞混合打印[9]。鈦及其合金是目前應用最廣泛的金屬支架材料，Nune等[10]采用3D打印技術制備3種不同孔徑及孔隙率的多孔鈦（porous titanium,pTi）支架，平均孔徑分別為700、1000、1500 μm，孔隙率分別為76.1%、85.6%、90.3%，通過與前成骨細胞共培養檢測其生物學功能，結果顯示pTi支架均有利于前成骨細胞黏附、增殖、礦化及分化，不同孔徑鈦支架之間細胞活性差異無統計學意義。鄧威等[11]將3D 打印pTi 材料植入兔股骨髁缺損，術后第12周Micro-CT掃描及硬組織切片染色結果均顯示材料周圍及孔隙內長入大量新生骨組織，表明3D打印pTi材料具有優異的骨修復性能。鉭、鈮金屬因其高容積孔隙率、低彈性模量及高表面摩擦性能，成為金屬材料研究的熱點。但是鉭、鈮材料價格昂貴，且具有強氧化性和高熔融溫度，使得3D打印純鉭、鈮多孔支架的研究受到極大限制，目前多將鉭、鈮金屬制作成涂層用于傳統金屬材料（如鈦合金、不銹鋼等）表面改性處理，以節約成本，并增強支架骨修復性能[12,13]。鈦、鉭、鈮等金屬因不具有生物可降解性，致使其研究受限，而鎂金屬作為一種新型可降解金屬材料，是今后的研究熱點，其植入體內后可降解成無毒物質排出體外，且降解過程中釋放鎂離子，可促進成骨反應。然而純鎂生理環境中降解太快，骨組織愈合之前就失去力學性能，且降解過程中會產生過多氫氣，超過宿主組織的處理能力，所以當前鎂金屬的研究側重于制備鎂合金材料或構建其他保護涂層以增強鎂金屬的抗腐蝕性能[14,15]。Yu等[16]采用激光打孔法制備多孔鎂合金支架，并構建氟化鎂涂層以提高支架的抗腐蝕性能，通過與骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）共培養以探討支架的細胞相容性，結果表明氟化鎂涂層多孔鎂合金支架具有良好的生物相容性，并能促進BMSCs的增殖活性。

1.2 生物陶瓷材料

生物陶瓷類似于天然骨的無機成分，可提供優良的骨傳導性能，并具有良好的生物相容性、生物降解性及較強的抗壓性能，部分抗壓強度可達到松質骨生物力學要求。常用的生物陶瓷材料主要包括羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）、β-磷酸三鈣（β-trical?cium phosphate,β-TCP）、雙相磷酸鈣、磷酸鎂（magne?sium phosphate,MP）、氧化鋁、氧化鋯等。但生物陶瓷脆性大、韌性差、剪切應力低，且降解不全，同樣需要特定的高溫條件進行3D 打印，不能同步涂層生物活性因子或抗感染藥物[9]。Warnke 等[17]運用3D 打印技術分別制備HA 及磷酸三鈣（tricalcium phosphate,TCP）多孔支架，并以商品化的骨替代材料Bio-Oss?作為對照，進行材料的表征及生物相容性研究，細胞活力染色、MTT、LDH、WST 結果均顯示HA 多孔支架的生物相容性優于Bio-Oss?材料，而Bio-Oss?材料的生物相容性又優于TCP 多孔支架。在材料表面制備類似于骨小梁的微孔結構，可以為骨組織的長入提供條件，Kim等[18]采用3D打印結合自固化反應及鹽析法制備表面具有微孔結構的MP多孔支架，與表面無微孔結構的MP多孔支架相比，其孔隙率、降解性能、骨生成及骨塑形能力大大增加。摻雜功能性元素的生物陶瓷3D 打印研究同樣受到廣泛關注，Deng 等[19]將含錳元素的β-TCP 通過3D 打印技術制備成有序大孔結構的支架，錳元素的引入顯著提高支架的抗壓強度及致密度，且隨著支架的降解緩慢釋放錳離子，刺激軟骨生長，加速軟骨下骨的修復。Tarafder等[20]應用3D打印技術制備含鍶及鎂元素的TCP多孔支架，通過大鼠體內實驗驗證同樣具有優異的骨修復性能。然而，傳統3D 打印工藝制備的多孔支架多由實心基元堆疊而成，降低了材料的孔隙率；且多孔支架的孔隙呈階梯三維延伸狀，不是平直的管道狀，在流體力學方面存在較強的流體阻力，不利于營養物質的擴散及細胞的長入。Feng 等[21]受到自然界中蓮藕內部平行多通道結構的啟發，采用3D 打印制備出空心管基元堆疊而成的仿生蓮藕支架，與傳統3D打印多孔支架相比，擁有更高的孔隙率，更有利于骨細胞黏附、增殖及骨組織再生，且該方法可用于多種生物陶瓷（鎂黃長石、氧化鋁、氧化鋯）、金屬材料等制備仿生蓮藕支架，擁有廣闊的應用前景。

1.3 聚合材料

聚合材料可分為人工合成聚合材料和天然聚合材料。人工合成聚合材料主要有聚乳酸[poly（lactic acid）,PLA]、聚乙醇酸、聚己內酯（polycaprolactone,PCL）、聚乙二醇、聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly（lac?tic-co-glycolic acid）,PLGA]等，這類材料來源廣泛，具有良好的生物相容性及生物降解性，且可按需定制，優化其化學和生物力學性能。然而人工合成聚合材料多難溶于水，常需氯仿等有機溶劑作為黏結劑，但氯仿難以完全去除易導致毒性反應；人工合成聚合材料降解產生酸性產物，易引起炎癥反應；局部環境低pH 可加速材料降解，影響支架的機械強度[9]。單一3D 打印人工合成聚合材料各有優缺點，Danilevicius 等[22]采用3D 打印技術制備4 種不同孔隙率及孔徑的多孔PLA支架，孔隙率分別為70%、82%、86%及90%，孔徑分別為25 μm、50 μm、70 μm及110 μm，研究多孔支架孔隙率對前成骨細胞生物學特性的影響，結果顯示孔隙率為70%的多孔支架未見細胞長入，孔隙率為86%的多孔支架最有利于細胞黏附生長。Park等[23]運用3D打印技術分別制備多孔PCL支架、多孔PLGA 支架，體外實驗表明兩種支架材料均具有良好的生物相容性，通過12 周兔體內實驗表明兩種支架材料均可不同程度的促進骨再生，但PLGA支架降解過快，不能提供足夠的力學支撐，從而導致PLGA支架的骨修復性能弱于PCL支架。兩種人工合成聚合材料制備復合支架的研究也備受關注，Kim和Cho[24]以PCL、PLGA為原材料，應用新型多頭沉積技術制備PCL/PLGA多孔支架，該支架具有600 μm的均一孔徑和69.6%的孔隙率，在細胞實驗中表現出良好的生物相容性。局部氧化可提高人工合成聚合材料的性能，有研究表明隨著氧化程度的增加，聚乙烯醇多孔支架的降解程度及蛋白釋放特性均顯著增強[25]。天然聚合材料常見的有膠原、殼聚糖（chitosan,CS）、絲素蛋白、海藻酸鹽、透明質酸、脫鈣骨基質等，這類材料具有良好的生物相容性、生物降解性，并具有天然多孔結構及優異的親水性能，有利于細胞黏附、增殖及分化。天然聚合材料均可用于骨修復多孔支架的3D打印，但他們難以大量獲取，且降解速率過快并缺乏一定的生物力學強度，較少單獨用作組織工程支架材料，常作為生物活性材料應用于復合多孔支架的制備[2,26]。

1.4 復合材料

復合材料由兩種或更多種不同的材料如金屬與生物陶瓷、聚合材料與生物陶瓷等構建而成，可綜合各種材料的優點，取長補短，以更大程度滿足組織工程多孔支架的需求。3D打印技術制備的金屬多孔支架表面構建生物陶瓷或聚合材料涂層，即將金屬多孔支架的優異力學性能與生物陶瓷、聚合材料的優異生物學性能有機結合，是金屬多孔支架復合材料研究的熱點。Ma等[26]應用冷凍干燥技術在3D打印制備的pTi支架表面成功構建CS/HA涂層，該復合支架的生物力學性能與自然骨相匹配，較未涂層pTi支架更適合成骨細胞的黏附、增殖，是一種理想的負重部位骨修復材料。Li等[7]借助仿生技術成功制備HA/聚多巴胺涂層3D打印pTi支架，與未涂層pTi支架相比，細胞黏附增殖及成骨活性顯著增強；通過將復合涂層pTi支架植入兔股骨髁骨缺損模型中，發現HA/聚多巴胺涂層改性處理可以顯著提高pTi支架的骨修復及骨整合能力。

聚合材料與生物陶瓷的結合，如同骨組織中有機成分與無機成分的結合，更接近真實的骨基質環境，被廣泛用于骨組織工程研究。低溫3D打印技術可以保留聚合材料與生物陶瓷材料的自然屬性，是近年來3D打印研究的新突破。Lin等[2]利用低溫3D打印技術構建基于膠原/HA的仿生多孔支架，該支架具有三維交聯的多孔結構并基本保留了原材料本身的特性，與非打印支架相比，可以顯著提高細胞黏附及促成骨作用。Jakus等[27]將90%HA與10%PCL（或10%PLGA）混合，作為3D打印墨水，室溫下制備成超彈性多孔支架，這種支架表現出良好的彈性及韌性，在受到擠壓時可迅速復原，且支持細胞生長、增殖，并可誘導成骨分化；通過將支架植入大鼠脊柱融合模型及猴顱骨缺損模型中發現，該超彈性多孔支架可與周圍組織快速整合，并可促進血管生成及骨再生。金屬功能性元素也可摻雜于復合材料中，Li等[28]應用低溫3D打印技術將具有促成骨活性的金屬鎂均勻復合入PLGA/TCP可降解多孔支架中，該復合支架具有極高的孔隙連通性和理想的仿生多孔結構，在體外研究中，表現出優異的骨傳導及骨誘導活性，可促進骨組織的生長。

在復合支架的研究中還可以根據需要添加生物活性分子，使得支架具有更強的骨再生能力。淫羊藿苷是一種具有促成骨活性的天然植物小分子，Lai等[29]將淫羊藿苷與PLGA/TCP 材料均勻混合，應用低溫3D 打印技術制備成多孔復合支架，該多孔支架具有優異的骨傳導特性能力，復合的淫羊藿苷可以在植入部位穩定釋放活性成分，原位促進植入部位的新骨再生。軟骨源性形態發生蛋白1 因其特有的促軟骨形成的作用而受到廣泛關注，徐燕等[30]利用3D 打印技術制備PCL/HA支架，借助多巴胺表面修飾，將軟骨源性形態發生蛋白1負載于支架上，體外與人BMSCs共培養，可明顯促進細胞黏附、增殖及成軟骨分化。

2 3D細胞或組織打印

3D 打印的細胞或組織打印技術是將細胞、生長因子與支架材料同時打印，制備出帶有生命的“活”的支架。其優勢在于：①相比于在已成型的支架中接種細胞，其可以獲得更高的細胞密度；②可精確調控細胞的空間分布，進而調節細胞間、細胞與支架材料間的相互作用，促進細胞最終形成功能活性組織[9]。目前，3D細胞和組織打印主要是基于攜帶細胞的水凝膠3D 沉積技術，尤其在軟骨組織工程支架的構建中應用最為廣泛。聚合材料是最常見的打印墨水，Markstedt 等[31]將納米纖維素、藻酸鹽混合作為打印墨水與人軟骨細胞一起進行3D 打印，以軟骨組織的CT掃描數據為模板，打印出半月板及人耳，經過7 d的培養后，該復合物仍表現出86%的細胞活性。Kun?du 等[32]將PCL 和封裝軟骨細胞的藻酸鹽通過多頭沉積技術進行3D 打印構建軟骨組織支架，通過裸鼠皮下種植可見軟骨細胞分化良好。生物陶瓷材料也可用于3D 細胞或組織打印，Gao 等[33]將人BMSCs 與生物活性玻璃（bioactive glass,BG）及HA納米粒混合共同打印，經過21 d的培養，細胞活性及復合物的彈性模量均明顯增強。然而，大多數生物打印墨水難以模擬天然細胞外基質的復雜環境，無法完美重建細胞的形態及功能。Pati等[34]以脫細胞的細胞外基質作為打印墨水，裝載細胞后打印，能為細胞生長提供一個優異的微環境，且這種方法具有多樣性及靈活性，可用于軟骨、脂肪及心臟組織的打印。

3 3D打印載藥材料

載藥的3D打印多孔支架通常是在傳統多孔支架的基礎上，以其為基底，再經過不同技術處理以載入相應抗菌、抗結核等藥物。Han等[35]運用電沉積技術在3D打印制備的多孔鈷鉻支架表面構建絲素蛋白-慶大霉素復合涂層，結果顯示金屬支架的力學強度沒有受到電化學腐蝕的影響，同時涂層改善了支架材料的生物活性并具有良好的抗菌性能。銀及納米粒子因具有良好的抗菌活性而受到廣泛關注，Zhang等[36]首先制備3D打印β-TCP多孔支架，然后應用浸漬法構建載銀納米氧化石墨烯復合涂層，通過革蘭陰性菌的抑菌實驗評估，該復合支架表現出優異的抗菌活性，通過與兔骨髓基質細胞共培養，發現其可顯著提高堿性磷酸酶活性及成骨相關基因的表達。骨關節結核治療中，為避免長期抗結核藥物治療帶來的耐藥性及全身毒副作用，有研究通過前期化學改性處理的BG和二氧化硅納米粒為基材負載異煙肼和利福平，運用3D打印技術制備分層多孔復合支架，體內外實驗表明，與商品磷酸鈣載藥支架相比，該復合支架具有優異的抗結核藥物緩釋特性，且可維持體內有效殺菌濃度達12周之久[37]。除了可以有效抗結核治療外，該復合支架還具有良好的骨缺損修復性能。這種結合優異抗菌、抗結核活性與良好成骨性能于一體的雙功能多孔復合支架在感染性骨缺損的修復重建及骨關節結核的治療中擁有廣闊的應用前景。

4 總結與展望

雖然3D打印多孔材料具有個性化及多樣化的優勢，但其研發仍然存在一些不可回避的問題：①目前對于可以維持細胞活性及其功能的生物活性材料的研究還處于實驗階段；②3D打印多孔組織工程支架的最適參數尚無定論[3,38]，如支架的最適孔徑、孔隙率、降解速率等。目前3D打印機的分辨率較低，遠達不到骨組織納米級的超微結構水平，故還需提高打印設備的分辨率來增強支架的性能；③人體骨組織是由蛋白質、鈣等多種物質組成，其力學性能適應人體需求，而傳統3D打印多孔支架通常局限于單一材料，支架性能與骨修復需求不吻合，綜合多種材料的優點來構建骨組織工程復合支架的研究還較少；④在細胞或組織打印方面，目前只能運用單一活性細胞進行打印，無法同時構建神經、血管網等精細結構，不能重現人體組織、器官功能的復雜多樣性；⑤載藥3D打印多孔支架的研究還處于初級起步階段，對于藥物釋放特性及支架的成骨性能、降解性能還不能完全匹配。

目前，4D打印的理念[39,40]已被提出，即在3D打印三維的基礎上加入了時間的維度，使打印的物體可以隨時間發生動態改變，不再是靜止、無生命的，增加了打印物體結構和功能的可設計性，但仍需更深入的研究，以滿足不同患者的臨床需求。