響應面法優化豆渣纖維酶解多糖制備工藝及其抗氧化活性研究?

姚 磊 ，陳昊 ，孫樹坤 ，楊秋萍 **

（ 1.東北農業大學國家大豆工程技術研究中心，哈爾濱 150028； 2.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱 150028）

我國是世界上主要的大豆生產國和消費國[1]，據美國大豆協會（Soy-base.org)統計表明，2017/2018年度，中國大豆年產量約1 500萬t，進口約9 500多萬t，總消費量達到11 000萬t，主要用于油料和大豆蛋白制品加工[2]。大豆豆渣（簡稱豆渣）是大豆加工產業的主要副產物[3]，含有豐富的粗纖維（Soybean crude fiber，SCF），約占 60%～70%，由于其水溶性低、口味差和不耐貯藏等缺陷，一般都作為飼料或廢棄物處理[4]，不僅浪費大量的可利用資源，且容易造成環境污染[5]。

多糖（Polysaccharide）是由10個以上的單糖以糖苷鍵相連而成的聚合物，廣泛存在于動物、植物和微生物中，是生命體重要的組成成分，與多項生命活動密切相關[6]。研究發現，多糖具有抗氧化[7-8]、抗輻射[9-10]、抑制腫瘤[11]、免疫調節[12-13]和降血糖[14]等多種生理活性[15-16]和功能。有關大豆水溶性多糖的提取工藝[17-19]及其應用[20-22]已經有了一定的研究報道，但對其非水溶性多糖部位精深開發利用的報道較少。

以豆渣為原料，制備得到大豆粗纖維（Soy?bean crude fiber，SCF），繼而以SCF作為底物，采用纖維素酶進行降解制備具有生物活性的水溶性多糖（Polysaccharides from soybean residue，SRP），對酶解工藝進行優化，并通過抗氧化活性跟蹤，確定最佳抗氧化多糖片段SRP，為進一步研究大豆抗氧化多糖在體內對氧化損傷的防護功效提供理論基礎，同時為大豆副產品的精深加工利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆渣，實驗室自制；氫氧化鉀，天津市津東天正精細化學試劑廠；硫酸（98%），天津市耀華化學試劑有限責任公司；鹽酸（36%），哈爾濱市新春化工廠；纖維素酶AccelleraseTM1000，無錫杰能科生物工程有限公司；過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵和三氯化鐵，天津市科密歐化學試劑制造有限公司；ABTS，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋HWS24，上海一恒科技有限公司；旋轉蒸發儀R-1002-VN，鄭州長城科工貿有限公司；pH計PB-10，德國Sartorius；電子分析天平R200D，德國Sartorius；離心機JDZ5-2，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆粗纖維制備

豆渣經去除脂肪、淀粉和蛋白等成分，所得參與固體成分經洗滌，干燥后即得大豆粗纖維（SCF）。將豆渣經石油醚（30～60℃）提取劑回流，去除豆渣中的脂肪類物質，之后于1.25%H2SO4微沸60min，水洗至中性，再經1.25%KOH微沸60min，水洗至中性，過濾，所得的殘渣經低溫真空干燥后即為大豆纖維多糖制備底物SCF。以此法制備SCF，得率為68.30%，按GB/T 5009.10-2003定粗纖維含量為93.25%。

1.3.2 酶解工藝單因素條件優化

（1）SRP得率計算

準確稱取一定量SCF，經纖維素酶水解后固液分離，制得水溶性多糖SRP分布于上清液中，殘渣烘干后稱重，按式1計算SRP得率：

式中：W0為降解前SCF質量；Wi為降解后SCF殘渣質量。

（2）酶用量對SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，加入濃度0.1 mol/L，pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，制成5%纖維懸液，然后分別按20 U/g、40 U/g、60 U/g、80 U/g、100 U/g加入纖維素酶液，50℃降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測定SRP得率。

（3）pH對SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，分別加入濃度0.1 mol/L，pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，制成纖維懸液，然后按20 U/g加入纖維素酶液，50℃降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測定SRP得率。

（4）溫度對SRP得率的影響

分別稱取5份5.00 g SCF，移入250 mL三角瓶中，加入濃度0.1 mol/L，pH 5.0的醋酸鈉緩沖溶液100 mL，按20 U/g加入纖維素酶液，分別于30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下，降解1 h后，沸水浴加熱10 min，測定SRP得率。

1.3.3 SCF酶解工藝響應面試驗

根據上述單因素實驗確定的SCF最佳降解酶用量、pH和溫度為基礎，設計響應面實驗，進一步優化SRP制備工藝。各因素編碼水平見表1。

利用Design expert V8.0.6軟件對SRP制備條件優化的3因素進行響應面試驗設計，降解結束后將降解液以4 000 r/min的轉速離心10 min，收集上清液，計算各組實驗條件下SRP得率，比較制備效果并進行分析。

1.3.4 最佳抗氧化活性大豆多糖片段的篩選

SRP酶法制備最優工藝參數下，將纖維酶解不同時段，所得產物經總還原力測定，ABTS自由基和羥基自由基清除能力實驗，對其抗氧化活性進行比較，確定最佳抗氧化活性片段。

（1）羥基自由基的清除

參考Li[23]等的方法，在測定管中依次加入1 mL不同濃度樣品溶液，水楊酸（9 mmol/L）1 mL，硫酸亞鐵（9 mmol/L）1 mL，最后加入1 mL過氧化氫（8.8 mmol/L），漩渦振蕩混勻，啟動反應。在37℃水浴30 min，反應結束后，在510 nm處測定吸光度Ai，對照管中以等體積蒸餾水代替過氧化氫測定吸光度Ai0，標準管中以等體積蒸餾水代替樣品測定吸光度A0。羥自由基清除能力按式2計算：

（2）總還原力測定

測定采用普魯士藍法[24]，操作參考王博等[25]的方法，25 mL具塞比色管中，分別加入不同濃度（10～120 μg/mL）SRP溶液、PBS緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）、1%鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]液各2.5 mL，混合均勻后于50℃水浴中保持20 min。反應結束后迅速冷卻，加入2.5mL10%三氯乙酸（TCA），以4 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液2.5 mL于試管中，分別加入2.5mL蒸餾水，0.1%的三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，靜置反應10 min，測定700 nm波長處的吸光值Ai，以蒸餾水代替不同濃度SRP，同法操作測定吸光度值A0。以反應體系吸光度值（Ai-A0）來評價SRP的總還原能力，吸光值越大表示其還原力越強。

表1 響應面試驗因素及變量水平

1.4 數據處理與分析

實驗中測定結果做3次重復，每次做3個平行。最后結果以平均值±標準方差（means±SD）表示。結果采用SPSS（Version 22.0）軟件進行統計分析，以P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 SRP制備單因素實驗結果

2.1.1 酶用量對SRP得率的影響

由圖1可知，在pH 5.0、溫度50℃條件下，考察酶用量對SRP得率的影響。在酶用量20～60 U/g，隨著酶用量的增加，SRP得率增加趨勢明顯。超過60 U/g以后，繼續增加酶用量，SRP得率基本不再變化。由于底物濃度是固定的，隨著酶用量的增加，酶底比逐漸增加，因此反應速率呈現明顯的上升趨勢，當酶用量達到60 U/g后，酶在纖維表面的分散達到飽和狀態，此時繼續增加酶用量，SRP得率并無明顯增加。

纖維素酶的用量是直接決定纖維降解成本的最重要因素之一[26]，因此在滿足一定降解效率的情況下，盡量選擇最低的酶用量。考慮酶用量40 U/g組與60 U/g組間差異無顯著性（P＞0.05），故選擇40 U/g為降解制備SRP單因素的最佳酶用量。

圖1 酶用量對SRP得率的影響

2.1.2 pH對SRP得率的影響

pH對SRP得率的影響如圖2所示。溫度50℃，降解時間1 h，在pH 3.5～5.0，隨著pH的增加，得率逐漸上升，至pH 4.5時SRP得率為41.66%，pH 5.0時達到最大值44.25%。此后隨著pH繼續增加，SRP得率表現出持續下降趨勢。

圖2 pH值對SRP得率的影響

纖維素酶降解是固液反應，是水溶性的纖維素酶與粗纖維結合產生的一系列生化反應過程。纖維素酶先要吸附在底物上，所以說纖維素與纖維素酶的接觸性是酶解反應的關鍵因素。詹小明等[27]利用玉米芯為纖維底物，進行纖維素酶降解研究發現，pH 4.8時，外切型β-葡聚糖酶（C1酶）、內切型β-葡聚糖酶（CMC酶）能大部分穩定地吸附到玉米芯上，而纖維二糖酶（CB酶）主要游離在酶解液中，當pH升高或降低時，纖維素酶吸附率尤其C1酶的吸附率明顯下降，不利于纖維素酶的吸附和降解反應的進行。因此，由實驗結果確定SRP降解最適pH為5.0。

2.1.3 溫度對SRP得率的影響

溫度對SRP制備效果的影響如圖3所示。在30～50℃，隨著溫度的升高，SRP得率明顯增加，溫度為50℃時，SRP得率達到最大值44.67%。溫度55℃時SRP得率略有下降，60℃時SRP得率出現更明顯下降。鄭曉燕等在香蕉皮不溶性纖維酶法降解特性研究中也發現了相似的趨勢[28]。

圖3 溫度對SRP得率的影響

通常溫度的升高可以增加反應物分子活化能，起到促進反應進行的作用，有利于增加SRP得率，在30～50℃較好的體現了這一趨勢。但是在溫度高于50℃時，SRP得率并未隨溫度的增加而繼續增加，甚至在較高溫度下出現明顯下降。這是因為，酶促反應速率的最大決定因素應該是酶的活性，而酶的化學本質是蛋白質，在溫度高于50℃時，酶蛋白開始發生一定程度的變性，帶來酶分子空間構象上的改變，甚至影響活性中心構象，使得底物不能與酶發生很好的誘導契合，因此引起酶促反應速率的下降，嚴重時甚至可能引起酶失活，導致酶促反應無法進行，由此確定50℃作為SRP最適制備溫度。

2.2 響應面法優化SRP制備工藝

經單因素實驗得出固液比、pH、溫度和酶用量的最優值分別為：固液比1∶20，pH 5.0，溫度50℃，酶用量40 U/g。經分析比較，各影響因素中pH、溫度和酶用量對SRP得率影響相對較大，因此在單因素實驗研究基礎上，通過響應面法設計，對影響SRP得率的3個因素pH、溫度和酶用量進行中心組合試驗。響應面分析方案及試驗結果見表2。

根據表2中試驗結果回歸擬合所得回歸模型如下：

對二次多項回歸方程進行顯著性驗證，結果見表3。由表3可見，模型的一次項X1-酶用量和X2-pH影響系數極顯著，X3-溫度影響不顯著，交互項X1X3和X2X3系數顯著，而交互項X1X2的系數不顯著。

對二次多項回歸方程進行方差分析，結果見表4。由表4可知，相關系數R2=0.983 2，響應面回歸模型高度顯著（P＜0.000 1），模型失擬項（P≤0.143 8），不顯著，說明該二次模型擬合充分，可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。

表2 響應面分析方案及試驗結果

表3 響應面分析優化后模型的系數檢驗

表4 響應面回歸模型方差分析

圖4、圖5與圖6分別為X1-酶用量、X2-pH和X3-溫度3因素影響SRP得率的響應面及等高線分析圖。由圖4可見，在pH 4.5～5.0，X1-酶用量、X2-pH表現為對SRP得率互惠的交互作用。酶用量一定的情況下，SRP得率隨著pH的增加明顯增加，當pH大于5.0后，SRP得率則逐漸下降。由圖5可見，酶用量和溫度在低水平范圍內，隨著溫度和酶用量的增加，SRP得率迅速增加，二者表現出明顯的交互作用。溫度在47.5～52.5℃，酶用量30～60 U/g，SRP得率可達到最高水平。由圖6可見，響應曲面的坡度相對較陡，表明響應值（SRP得率）對溫度和pH的變化敏感。在pH4.5～5.0，SRP得率隨溫度的升高迅速增加，在溫度50℃，pH 5.0附近達到最高水平。

結合回歸模型的數學分析結果與響應面圖及等高線分析圖確定SRP制備最佳工藝參數為：酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度49.64℃。回歸模型預測的理論降解率可達到45.73%。實際制備條件采用酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度50℃，重復3次試驗，所得SRP得率分別為：45.58%、45.81%和45.74%，平均得率為45.71%，與理論預測值相比相對誤差為0.44%，可見該模型能較好地模擬和預測纖維素酶制備SRP的得率。

圖4 pH值和酶用量交互作用對SRP得率的影響

圖5 溫度和酶用量交互作用對SRP得率的影響

2.3 抗氧化活性多糖片段的篩選

多糖的分子量，對其功能性具有十分重要的影響[29]。酶解時間對纖維的酶解產物分子量分布具有很大的影響，隨著酶解時間的增加，SRP得率呈增加趨勢，其平均分子量也逐漸下降。在所得酶法制備SRP最優工藝參數下，將SCF酶解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h不同時間，得到6組多糖活性片段，對所得產物進行總還原力和羥基自由基清除能力實驗，對其抗氧化活性進行比較，確定最佳酶解時間和最佳活性多糖片段。

圖6 溫度和pH交互作用對SRP得率的影響

2.3.1 不同多糖片段總還原能力

多糖片段的還原能力是其抗氧化活性的重要指標，抗氧化劑給自由基提供電子，將三價鐵還原成二價鐵形成普魯士藍著色復合體，通過分析在700 nm波長下吸光值，吸光度值越高表明多糖還原能力越強[30]。

總還原能力測定結果如圖7所示，6種SRP多糖片段的總還原能力均隨著濃度的增加而逐漸增強，并表現出良好的劑量依賴性。當濃度在1～10 mg/mL，6種SRP的總還原能力呈線性明顯增加，此后繼續增加濃度，吸光值增加趨勢趨于平緩。當濃度為40 mg/mL時8 h組吸光值最高（0.778），其次為6 h組（0.728）和10 h組（0.692），2 h、4 h和12 h組則都低于0.600。

圖7 不同降解時段SRP總還原能力

實驗結果表明，6種SRP多糖片段表現出較好的總還原能力，從2～8 h，隨著降解時間的延長，SRP還原能力也逐漸增加，這可能與多糖片段增加，還原端暴露的增加有關。而降解時間繼續增加，所得SRP片段總還原能力則表現出下降的趨勢，這有可能是降解度的增加，導致SRP組分中不具還原力的單糖相對含量增加引起總還原力下降的現象。

2.3.2 不同多糖片段對羥基自由基清除能力

不同降解時間所得SRP對羥基自由基清除效果如圖8所示。實驗結果顯示，2～12 h降解組分別表現出較強的羥基自由基清除作用，隨著SRP濃度的增加，羥基自由基清除率也增加，表現出良好的劑量依賴性。各組EC50分別為：8 h（3.91 mg/mL）＜6 h（5.18 mg/mL）＜12 h（5.19 mg/mL）＜10 h（7.97 mg/mL）＜ 4 h（16.65 mg/mL）＜2 h（29.74 mg/mL），即降解時間8 h組所得SRP組分對羥基自由基有著最強的清除效果。

3 結論

采用纖維素酶法制備了豆渣纖維多糖，并利用響應面分析法進行優化，得到SRP最佳制備工藝參數為：酶用量60 U/g、pH 5.10、溫度50℃，在此條件下，酶解1 h所得SRP得率為45.71%。

圖8 SRP對羥基自由基清除效果

通過測定總還原力和清除羥基自由基指標評價SRP抗氧化活性，結果顯示降解時間2～4 h所得SRP片段和10～12 h所得SRP片段抗氧化活性相對低于降解6～10 h時段所得SRP片段。其原因可能是降解時間相對較短的SRP片段相對分子量較大，溶解性較差，還原端暴露較少。而降解時間相對較長的SRP片段所含單糖、寡糖組分含量較高，失去多糖的抗氧化特性。而在降解6～10 h SRP片段中，降解時間8 h所得SRP片段表現出最強的羥基自由基清除能力。因此，確定在最優制備條件下，降解8 h所得為最佳抗氧化SRP片段。此外，在今后的研究工作中，應進一步深入研究SRP的精細結構，包括其分子量分布分析、單糖組成和構效關系等，將有助于更加深入的探討其生物學功能。