恒溫儲存條件下餐桌剩余食物中6種生物胺含量變化研究

■蔡云霞 楊 瑩 王 興 韓 晴 李 俊*

（1.中國農業科學院飼料研究所，北京100081；2.北京嘉博文生物飼料科技有限公司，北京100085；3.云南省獸藥飼料檢測所，云南昆明，650201）

根據化學結構，生物胺可分為：脂肪族，包括尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、胍丁胺等；芳香族，包括酪胺、苯乙胺、多巴胺等；雜環類，包括組胺、色胺等[1]。多種生物胺能夠與亞硝酸鹽反應，生成強致癌物質亞硝胺，因此生物胺亦被認為有潛在致癌性[2]。其中，組胺毒性最大[3]，酪胺的毒性次之，尸胺和腐胺毒性較低，但能通過抑制組胺和酪胺的代謝酶活性，增加組胺和酪胺的潛在毒性[4]。而且生物胺之間還存在相互轉化，毒性也受到其他各類生物胺含量及胺類氧化酶的影響。

餐桌剩余食物富含大量的有機質，主要由米面、蔬菜、肉蛋、骨頭、菜汁、油脂等組成，其主要成分包括蛋白質、脂肪、淀粉、纖維素等有機物，還含有較豐富的礦物元素。餐桌剩余食物是一種潛在的飼料資源，可以替代部分蛋白及能量原料[5-6]。餐桌剩余食物在收集、儲運過程中容易受微生物污染發生蛋白質腐敗，腐敗過程中會持續產生生物胺。餐桌剩余食物中的生物胺含量與基質的蛋白含量及其腐敗程度相關，生物胺可作為判斷餐桌剩余食物可飼料化利用的重要指標。飼料化處理企業可首先利用感官判斷餐桌剩余食物的腐敗狀況，再結合腐敗進程中所測的生物胺的值，判斷是否可以用于飼料化生產。

目前已經積累了大量的生物胺的檢測方法，色譜法有薄層色譜法[7-8]、離子色譜法[9-10]和高效液相色譜法[11-13]等；其他還有毛細管電泳法[14]、生物傳感器法[15]等。其中高效液相色譜檢測法（HPLC）具有定量分析準確，檢測靈敏度高，重現性好的特點，成為分析定量生物胺的主要檢測方法。生物胺檢測的衍生化階段，多數學者常選用丹磺酰氯、苯甲酰氯、鄰苯二甲醛（OPA）等作為衍生劑的柱前衍生。生物胺檢測的檢測器中，紫外檢測器是常用的一種檢測器，靈敏度較高；用高效液相色譜法搭配G1321A熒光檢測器檢測牙鲆體內生物胺，最低檢出限達1.5 μg/l[16]；二極管陣列檢測器也有用于食品中生物胺的檢測[17]；蒸發光散射檢測器不依賴于樣品的光學特性即可響應，可以節省生物胺檢測需要的衍生過程[13]。

本文參考了動物源性飼料的檢測方法（GB/T 23884—2009）[18]，餐廚廢棄物的反向高效液相色譜法[19]及水產品中生物胺的檢測方法[20]。作為需要批量檢測的條件下，在保證其準確性的前提下要盡量簡化檢測的步驟。在動物源性飼料中生物胺的檢測方法是針對均一性的魚粉進行檢測。與魚粉相比，餐桌剩余食物在凍干粉碎后較魚粉油脂含量高，并且成分復雜，而毛文成建立的餐廚廢棄物的生物胺檢測方法中生物胺提取方式相對復雜，油脂粘壁的情況很明顯，不利于準確計量生物胺含量，乙酸乙酯萃取效果較乙醚略差，因此本文對檢測方法進行了部分調整。

1 材料、儀器設備及試劑

1.1 材料

1.1.1 剛下餐桌的餐桌剩余食物

以中國農業科學院職工食堂作為取樣點（表1）。取樣時利用長柄漏勺取樣器，在餐桌剩余食物收集桶的表面、上中部、下中部三個層，每層隨機設5個點，即每個桶內取15個點樣，混合各點的樣品。剔除樣品中筷子、牙簽、餐巾紙、大塊骨頭等雜物，將樣品運回實驗室后于模擬條件下進行處理（下餐桌后約1～2 h）。

表1 餐桌剩余食物樣品采集登記

1.1.2 樣品制備

將收集的餐桌剩余食物分裝于3個6.0 L加蓋普通塑料桶中，30℃恒溫下處理72 h。分別于0、24、48、72 h時間點取混合樣測定。每個時間點取樣時，用玻璃棒（噴灑75%乙醇，紫外殺菌30 min）將桶中餐桌剩余食物充分攪拌混勻，用漏勺（酒精棉擦拭，紫外照射30 min）取約600 g餐桌剩余食物，使用研磨儀研磨后，取一定量的樣品（約200 g）于9號自封袋中（紫外殺菌30 min），將自封袋中餐桌剩余食物壓平封口，在-80℃條件下預凍4 h以上，再進行凍干處理。

將冷凍后的餐桌剩余食物樣品于冷凍干燥機中進行冷凍干燥約28～34 h至干。凍干后的餐桌剩余食物用粉碎機進行無菌粉碎（紫外照射殺菌），并于-20℃下凍藏，用于各指標的檢測。

1.2 主要儀器

LC-15C高效液相色譜儀（配紫外檢測器），日本Shimadzu公司；MG-2200型氮吹儀，日本Eyela公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Gradient MILLIPORE純水機，法國Milliq公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設備廠；Himac CR-22G高速冷凍離心機，Hitachi公司；LGJ-12冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；EYELA BATH SB-9電熱恒溫水浴鍋，日本Eyela公司。

1.3 主要試劑

酪胺鹽酸鹽（純度99.5%）、組胺鹽酸鹽（純度99.3%）、亞精胺鹽酸鹽（純度99.6%）、精胺鹽酸鹽（純度98.9%）、腐胺鹽酸鹽（純度99.0%）、尸胺鹽酸鹽（純度99.6%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純），德國Fisher公司；正己烷（色譜純），德國Fisher公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；苯甲酰氯（純度99%以上，北京化工廠）；其余試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 樣品的提取

稱取1.00～2.00 g樣品于50 ml具塞離心管中，加入20 ml 5%三氯乙酸溶液，渦旋振蕩1 min，振蕩提取30 min（轉速為200 r/min），將離心管離心10 min（4 000 r/min）。移取上清液5 ml至新離心管中，加入5 ml正己烷，渦旋振蕩2 min，靜置分層，離心5 min（3 000 r/min），棄去正己烷層備用。

2.2 樣品的衍生化

取2.00 ml提取液于10 ml具塞離心管中，向離心管中依次加入1 ml NaOH溶液（2 mol/l），20 μl苯甲酰氯，渦旋振蕩1 min，置于30℃恒溫水浴鍋中水浴40 min，每隔10 min渦旋振蕩30 s。加入2.00 ml飽和NaCl溶液中斷反應，再加入2.00 ml乙醚進行萃取，渦旋振蕩1 min后離心10 min（3 000 r/min），將離心管中的乙醚層移取至10 ml離心管中，重復萃取一次，將乙醚層合并至10 ml離心管中，用氮氣吹干，準確加入1.00 ml甲醇溶解殘渣，微濾（0.45 μm）后，濾液用于測定生物胺含量。

2.3 標準溶液的配制

2.3.1 標準儲備液

精確計算并稱取6種生物胺標準品，用0.1 mol/l HCl溶液配制成1 mg/ml的單組分生物胺標準溶液。

2.3.2 混合儲備溶液

取標準儲備液各1 ml，用0.1 mol/l HCl溶液定容至10 ml，形成單體生物胺質量濃度為100 μg/ml的混合儲備液，4℃冰箱保存。

2.3.3 混合標準液

用0.1 mol/l HCl溶液將混合儲備液稀釋成濃度分別為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的混合標準溶液。混合標準溶液的衍生按“2.2”執行，并繪制標準曲線。

2.4 液相色譜分析條件

色譜柱：Venusil XBP C18柱（4.6 mm ×250 mm，粒度5 μm）；柱溫：35 ℃；紫外檢測波長254 nm；進樣量：20 μl。流動相：乙腈/水（V/V），梯度洗脫，設定梯度洗脫程序見表2；流速為1.0 ml/min。

表2 梯度洗脫程序

3 結果與分析

3.1 生物胺色譜圖與保留時間

選擇流動相時分別嘗試了乙腈-水、甲醇-水，使用甲醇-水作為流動相時，低濃度含量的生物胺圖譜離基線較遠。用乙腈-水作為流動相時，7.5 min左右出峰，出峰時間合理，無拖尾現象。經過梯度洗脫得到標準品圖譜（見圖1），6種生物胺在20 min內得到了良好的分離，完全出峰，峰形對稱無拖尾現象，出峰時間集中在7～17 min之間。

圖1 20 μg/ml生物胺標準品圖譜（從左往右依次腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺）

3.2 線性范圍與檢測限

按照外標定量法作標準曲線，計算標準曲線的回歸方程及相關系數（見表3）。以單個生物胺標準液測定信噪比作為判斷標準，得到單胺的檢出限（S/N=3）與定量限（S/N=10）。

六種生物胺的峰面積與濃度在0.50～50.00 μg/ml線性范圍內線性關系良好，線性相關系數（R2）均大于0.996；各生物胺的檢出限在0.1～0.5 μg/ml，定量限在0.4～1.0 μg/ml。

表3 6種生物胺的標準曲線

3.3 加標回收率與精密度

選擇新產生的餐桌剩余食物作為添加回收試驗的樣品。稱取1.50 g新鮮餐桌剩余食物樣品4份，對照組不添加，其他添加水平分別為0.5、10 μg/ml和20 μg/ml，計算回收率，結果表明加標樣品的平均回收率在50.36%～131.53%；相對標準偏差RSD≤8.15%（n=6）（見表4）。

表4 加標回收率和精密度（n=6）

3.4 餐桌剩余食物的生物胺色譜圖與保留時間

由圖2所示，在實驗室恒溫30℃儲存48 h的生物胺圖譜，6種生物胺均有檢出，在色譜圖上分離效果較好，按照標準品色譜圖的保留時間確定生物胺類別，其中腐胺的峰值尤為突出，可見該批次餐桌剩余食物在避光30℃儲存48 h時，腐胺含量最高。

圖2 餐桌剩余食物中生物胺圖譜（從左往右，腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺）

3.5 恒溫儲存條件下生物胺含量的變化

餐桌剩余食物采集分裝完畢后，放置于30℃恒溫箱避光儲存，并于0、24、48、72 h均勻取樣，并檢測生物胺指標含量（如圖3所示），在30℃恒溫避光條件下儲存的餐桌剩余食物的不同生物胺含量產生了一定的變化，其中腐胺隨著時間的增長而增長的趨勢比較明顯，從0～48 h之間腐胺高速增長，48 h時腐胺含量達218.25 mg/kg，之后增長速度明顯減緩，漸趨于穩定，到72 h時腐胺含量為224.83 mg/kg。在細菌數量增長的同時，長時間的放置使得餐桌剩余食物生物胺含量增加，以腐胺增加為主，其次是組胺略有增加。

EFSA在聯盟范圍內將魚制品中組胺含量制定為≤100 mg/kg。國內GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產品衛生標準》規定：高組胺魚類（鮐魚、竹莢魚等青皮紅肉海水魚）≤40 mg/100 g、其他海水魚類≤20 mg/100 g，而對其他食品未進行限定。試驗中經72 h放置的餐桌剩余食物組胺為51.74 mg/kg，不超過國內魚類衛生標準，進一步證實了餐桌剩余食物飼料化的可行性。但工業化生產與實驗室的結果會有差異，有研究顯示工業規模化發酵醬油的生物胺含量高于實驗室生物胺含量達10倍[21]，因此規模化生產的日常監測工作非常必要。

毛文成[19]對不同基質的餐桌剩余食物在自然光照射的情況下腐敗進程進行研究，5種生物胺（腐胺、尸胺、精胺、組胺、酪胺）隨著時間的增長有升有降，但是尸胺的變化在米面類、油水類、肉菜類中均為增長最明顯的生物胺，38 h后迅速增加，最后趨于平緩，米面類餐桌剩余食物尸胺可達400 mg/kg，肉菜型高達800 mg/kg。毛文成[19]建議使用尸胺作為篩選餐桌剩余食物的特征性指標。但本實驗中腐胺的變化較其他幾種生物胺更明顯，尸胺的變化并不顯著，遠小于50 mg/kg。因此生物胺的變化，除基質不同以外還要考慮儲存條件的差異，直接選用尸胺作為特征性指標通用性尚有待考證。

圖3 恒溫30℃儲存的餐桌剩余食物中6種生物胺含量的變化

4 結論

建立了一種高效液相色譜同時測定餐桌剩余食物中腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺6種生物胺含量的方法。利用三氯乙酸提取，以苯甲酰氯作為衍生劑，進行樣品前處理，采用反相RP18色譜柱分離，乙腈-水作流動相梯度洗脫，在波長254 nm進行紫外檢測。結果6種生物胺在0.1～50 mg/kg的范圍內呈現良好的線性關系（R2＞0.996）。腐胺、尸胺檢測限達到0.1 mg/kg，精胺、亞精胺、組胺和酪胺檢測限為0.5 mg/kg。該方法簡便、快捷，可以用于餐桌剩余食物中6種生物胺的定性及定量測定。

將剛下餐桌的餐桌剩余食物加蓋后在30℃恒溫避光條件下儲存72 h，隨著儲存時間增加腐胺含量增長迅速，48 h后開始趨于平穩，而尸胺等其他生物胺含量增長速度較緩慢，與餐桌剩余食物單批次的基質構成有關。應同時檢測腐胺、尸胺及組胺等生物胺指標來判定餐桌剩余食物的腐敗情況。