混菌固態發酵玉米黃粉飼料的研究

■ 韓國棟 劉曉蘭* 王 燕 易春霞 江成英 姜未公 王 松 劉 驥

（1.齊齊哈爾大學食品學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

隨著我國畜牧業的發展，蛋白質飼料緊缺的問題日益突顯，然而，解決這一問題的主要途徑是開發新的飼料資源和合理利用現有的飼料資源；其中發酵蛋白飼料是提高蛋白利用率，減少蛋白資源匱乏的一個有效措施。玉米黃粉是玉米濕法淀粉生產的主要副產物，含有60%～65%（w/w）的蛋白質，主要以醇溶蛋白為主，可溶性差，且氨基酸組成不平衡，適口性不好，直接作為飼料使用蛋白質消化利用率低[1]。采用微生物發酵的方法可提高玉米黃粉蛋白的可溶性，相應地提高玉米黃粉作為飼料的動物消化利用率，對緩解蛋白質飼料緊缺問題具有重要意義。

發酵玉米黃粉飼料有良好的營養和功能性。鄭喜群等[2]用玉米黃粉發酵飼料飼喂鵪鶉，結果表明，試驗組平均日增重、每周體重增重量和屠宰率均高于對照組。苗國偉[3]用發酵玉米黃粉飼喂肉雞，結果表明，試驗組料重比明顯降低，盲腸中大腸桿菌數量明顯降低，乳酸菌數量顯著提高。Hodgkinson等（2000）[4]報道生長豬回腸內源氮的流量與日糧中寡肽的含量成正相關。這說明發酵后飼料對動物蛋白吸收有良好改善作用。

本課題以玉米黃粉、豆粕和麩皮為生產原料，以枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌為主要菌種，嗜熱乳桿菌為輔助菌種，對固體發酵玉米蛋白飼料的工藝條件進行優化，最大限度地提高可溶性蛋白含量，降低發酵成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌和嗜熱乳酸菌均由齊齊哈爾大學食品與生物工程學院生物工程專業實驗室提供；玉米黃粉由黑龍江龍鳳玉米開發有限公司提供；豆粕和麥麩均為市售。

1.2 儀器與設備

TU1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；RH-Q型全溫振蕩器：上海躍進醫療器械廠；MVS-1旋渦混合器：北京金北德工貿有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安有限責任公司；PYX-DHS-40×50-BS隔水式電熱恒溫培養箱和101-1-BS-2電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械廠；PB-10 pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 物料膨化

用雙螺桿膨化機分別膨化玉米黃粉、豆粕和麥麩。將玉米黃粉含水量調節為18%，豆粕含水量調節為16%，麥麩含水量調節為18%，放置過夜。膨化機的工作參數為160～180℃。1～1.5 MPa。膨化的玉米黃粉、豆粕和麩皮在室溫下干燥，用粉碎機粉碎，篩分，收集過40目膨化的玉米黃粉、豆粕和麥麩作為原料備用。

1.3.2 方法

粗蛋白含量、總氨基酸含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、水分、粗灰分、鈣含量和磷含量分別采用中華人民共和國農業行業標準GB/T 6432—1994、GB/T 14965—1994、GB/T 6433—1994、GB/T 5009—2003、NY/T 1459-2007、GB/T 20806—2006、GB/T 6435—1986、GB/T 6438—1992、GB/T 6436—2002和 GB/T 6437—2002方法測定[5-14]，以干物質為基礎計算測定結果。可溶性蛋白含量的測定方法采用福林酚法[15]；活菌總數測定采用平皿計數法。

1.3.3 培養基及培養方法

斜面培養基：PDA培養基、LB培養基。

斜面培養方法：將菌種從4℃冰箱取出，無菌操作，用接種環挑取培養物置于相應固體培養基上培養36～48 h，作為斜面菌種。

種子培養基：PDA改良培養基（1 L馬鈴薯液、20 g葡萄糖、18 g麥芽糖、5 g硫酸銨、5 g氯化鉀、5 g硫酸鎂、5 g氯化鈉、pH自然）、LB培養基、MRS培養基。

種子培養方法：將活化好的斜面菌種接入培養基中（250 ml三角瓶裝量 60 ml），180 r/min培養 36～48 h，作為種子液。

發酵培養基：黃粉35%、豆粕35%、麥麩30%、尿素0.5%、硫酸銨1%、糖蜜1%，加水至初始含水量45%。

發酵培養方法：將培養的種子液接入單向發酵袋中（5 kg規格發酵袋裝料2.5 kg），室溫培養4～15 d，作為發酵物。

2 結果與討論

2.1 物料原料配伍

從營養角度考慮，物料原料配伍后的蛋白質含量要滿足動物需要，各種氨基酸含量要豐富，組成要平衡；從物料成本考慮，玉米黃粉價格高于豆粕，豆粕價格高于麩皮；從發酵成本考慮，麩皮價格低廉，一般每千克價格不高于2元，其作為膨松劑使用便于好氧微生物發酵的通風控制，同時它也屬于能量飼料，麩皮中的淀粉可為微生物提供碳源；為了合理配伍發酵基礎培養基組成，將所用的玉米黃粉、豆粕、麩皮進行基本成分分析，其結果見表1。

表1 飼料原料的主要成分及含量（干基%）

由表1可知，這三種飼料原料中含有較豐富的可供微生物發酵利用的碳源、氮源和礦質營養物質，可以作為微生物的基質發酵利用，但這三種原料各有特點。黃粉中含有60%以上的蛋白質，粗纖維含量較少，鈣、磷含量較高；麩皮粗淀粉和磷含量最高，可為微生物提供碳源和礦物質營養物質；豆粕營養較為均衡，但粗淀粉和磷含量低。進一步又分析了這三種原料的氨基酸組成，結果如表2所示。

表2 飼料原料的氨基酸含量（%）

由表2可知玉米黃粉中的支鏈氨基酸和中性氨基酸含量相當高，但其氨基酸組成不平衡，而Lys嚴重不足，而大豆粕剛好含有較高的Lys含量。合理物料配比可以使氨基酸組成更加平衡，且物料配比是微生物能否充分發酵利用的關鍵，也是影響發酵成本的主要因素。為了合理調整物料配比，在原物料配比黃粉35%、豆粕35%和麩皮30%基礎上，對物料進行了膨化預處理，預實驗結果表明，僅膨化黃粉時物料疏松度和通風效果更好，發酵物中的可溶性蛋白含量由75.3 mg/g（未膨化）提高到94.6 mg/g（膨化），此時對發酵更有利。因此，選取了膨化的黃粉35%、豆粕35%和麩皮30%作為原料。

2.2 固態發酵

2.2.1 接種量的確定

出于對種子培養成本的考慮，在原混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=1∶1∶1基礎上，做了預實驗，發現混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1時，發酵效果較好，發酵物醇香味最濃厚，活菌數最高達3.67×107CFU/g（濕基）。在發酵時間為4 d，溫度30℃，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察接種量1%、2%、5%、10%對固體發酵的影響，其結果見圖1。

圖1 接種量對可溶性蛋白的影響

從圖1中可以看出在實驗的接種量范圍內，各接種量條件均可以使發酵物可溶性蛋白顯著提高，接種量對發酵物中可溶性蛋白含量的影響不大。結果表明，該物料配伍和菌株混合比例的條件下，可以采用1%的低接菌量，這在工業生產條件下使得種子培養負擔小。

2.2.2 含水量的確定

含水量對固態發酵有較大的影響，菌群在發酵飼料時需要一定的水分，初始含水量的增加，可以通過增加發酵底物營養物質的溶解和微生物代謝產物的擴散來促進微生物的生長（Gervais等1996）[16]。水分太多會降低發酵能力；同時，也會造成發酵底物多孔性的降低，影響氧氣和熱量的傳遞；水分太低也會影響發酵產生可溶性蛋白含量的能力。在發酵時間為4 d，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，溫度30℃，接種量1%，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察物料含水量（ml/g干基）0.4、0.6、0.8、1.0對固體發酵的影響，其結果見圖2。

圖2 料水比對可溶性蛋白的影響

從圖2中可以看出在實驗的含水量范圍內，含水量對發酵物中可溶性蛋白含量影響較大，當每克物料（干基）加入0.8 ml水時，發酵物可溶性蛋白含量最高，其可溶性蛋白含量為97.24 mg/g。

2.2.3 發酵溫度的確定

發酵溫度是影響固態發酵的一個重要因素，因為微生物的生長和代謝都是在各種酶的催化下進行的，溫度是保證酶活性的重要條件（Raghavarao等，2003）[17]。可溶性蛋白含量的增加與酶有較大關系，從酶動力學來看，溫度越高反應速度越快，發酵過程中微生物生長量加快，而酶很容易因高溫而失活。因此，發酵溫度的確定很關鍵。在發酵時間為4 d，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，含水量0.8 mg/kg，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕：麥麩=7∶7∶6的條件下，考察溫度26、28、30、32℃對固體發酵的影響，其結果見圖3。

圖3 發酵溫度對可溶性蛋白的影響

從圖3中可以看出培養溫度30℃時，發酵物的可溶蛋白含量最高，培養溫度32℃時次之，接種溫度28℃時最低，接種溫度26℃時居中，初步確定最優溫度為30℃。結果表明，發酵的最適溫度可能跟三種菌株各自的適宜的生長溫度有關；而常用的飼用芽孢桿菌和乳酸菌適宜生長溫度是30～37℃，常用的飼用酵母菌適宜的生長溫度是24～32℃。綜合考慮，可以選用30℃的發酵溫度。

2.2.4 發酵時間的確定

發酵時間是多菌種組合固態發酵玉米黃粉飼料的主要參數，也是影響發酵效果的重要因素，其長短取決于發酵過程中微生物生長量、微生物本身的特性及微生物所分泌酶的酶解效率。在接種量1%，含水量0.8 mg/kg，混菌比例為枯草芽孢桿菌∶啤酒酵母菌∶嗜熱乳桿菌=4∶4∶1，溫度30℃，物料比例為膨化的玉米黃粉∶豆粕∶麥麩=7∶7∶6的條件下，考察發酵時間4、5、7、11、15 d對固體發酵的影響，其結果見圖4。

圖4 發酵時間對可溶性蛋白的影響

由圖4可以看出，最佳的發酵時間為7 d。此時玉米蛋白飼料中可溶性蛋白含量由59.09 mg/g（發酵前）提高到103.55 mg/g。發酵時間過短，微生物能利用養料繼續增殖，產物釋放不完全，發酵不徹底，不能去除培養基中的抗營養因子及生成足量的多肽；如果發酵時間過長，由于微生物自身新陳代謝，需要消耗營養物質，則營養損失大。因此，最佳發酵時間為7 d。

2.2.5 發酵玉米蛋白飼料常規成分分析

成分分析是飼料鑒定的基礎，準確地測量飼料中的成分是提高飼料利用率和有效地控制質量的關鍵。通過對發酵物的常規成分分析可以更好地評價其價值和品質；發酵對玉米黃粉飼料常規成分含量的變化如表3、表4所示。

由表3可以看出，混菌發酵玉米黃粉飼料使其中的營養成分發生了變化，發酵后可溶性蛋白明顯提高。

玉米黃粉飼料發酵前后水分、粗脂肪和磷含量差異顯著（P＜0.05），分別提高了 6.09%、10.53%和10.64%；粗蛋白質、粗纖維和粗淀粉含量差異顯著（P＜0.05），分別降低了10.13%、42.87%和20.56%；其他組分無顯著差異（P＞0.05）。發酵后進一步提高了玉米蛋白復合物飼料的品質和飼用價值。

表3 玉米黃粉飼料發酵前后的營養成分（%）

表4 發酵前后底物的氨基酸組成（%）

由表4可以看出發酵后比發酵前氨基酸總量有所降低，但實際的可溶蛋白含量卻增加了，同時也解釋了粗蛋白降低的原因；由此推測可能微生物生長需要一定的養分，消耗了部分氨基酸，代謝產出了游離氨基酸。

3 結論

以玉米黃粉、大豆粕和麥麩為發酵底物，得到發酵的玉米蛋白飼料。實驗范圍內的最適發酵底物組成是：膨化的黃粉∶豆粕∶麩皮=7∶7∶6，發酵底物加水量0.8 ml/g物料；適宜的發酵條件為接種量1%，溫度30℃，發酵時間7 d，結果表明，玉米蛋白飼料中可溶性蛋白含量由59.09 mg/g（發酵前）提高到103.55 mg/g（發酵后）；而其中粗纖維跟粗淀粉含量分別降低了42.87%和20.56%。在此背景下，混菌固態發酵玉米黃粉飼料可以取代仔豬日糧中10%到20%的豆粕，還可以作為營養調節劑使用，是飼料原料的充分補充，其具有發酵成本低、營養利用率高、無抗生素使用等優點，是家禽類養殖企業的新選擇。隨著發酵工藝條件優化，發酵飼料的品質也將逐步提升，這也將對其工業化生產有一定的借鑒意義。