酵母固態發酵仔豬配合飼料的工藝研究

■管軍軍 張天勇 高天增 王志祥

（1.河南農業大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001）

單菌種發酵作為固態發酵中常見的一種發酵形式，該發酵能夠明確菌種的發酵效果，與混菌發酵相比，其工藝參數容易控制，且無菌種間的抑制作用。酵母菌體蛋白含量較高，約為50%～60%，氨基酸構成合理，且富含B 族維生素，是一種優質的蛋白源。酵母菌發酵過程中能夠分泌大量水解酶類，降解抗營養因子，并產生多種生物活性物質。利用酵母發酵的飼料有抗病、強化營養和促進生長的效果。

但是，有關酵母固態發酵仔豬配合飼料的研究鮮有報道。本課題組結合固態發酵飼料的產業化實際情況，在科學設計試驗方案的基礎上系統地研究酵母固態發酵仔豬配合飼料生產技術，本研究主要集中在發酵的工藝參數對發酵產品主要營養指標（蛋白）的影響及工藝參數的優化，為酵母固態發酵仔豬配合飼料的實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酵母由河南省工業微生物菌種保藏中心提供，經過篩選馴化后，并加以輔料經冷凍干燥制成發酵劑（＞108CFU/g），冰箱5 ℃保存備用。仔豬配合飼料551H及552H 由河南廣安生物科技股份有限公司生產，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

1.2 主要儀器設備

SPX-250B 智能型生化培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；JJ-CJ-1FD 超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；FA2004B 電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 粗蛋白及其增加率的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發酵產品進行粗蛋白的測定，以干基表示(P)。

蛋白增加率(%)=（P發酵后-P未發酵）/P未發酵×100

1.4 發酵試驗

將酵母發酵劑接種到培養液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30 ℃條件下振蕩培養，轉速為150 r/min，培養4 h。取發酵劑活化液一定比例（v/v）接種到固態發酵培養基（仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水組成，裝料100 g/瓶）上。攪拌均勻后，置于培養箱中固態發酵，一定時間后取樣，50 ℃條件下干燥成品備用。

1.5 試驗設計

1.5.1 發酵時間、固態培養基組成、發酵溫度及接種量的影響試驗

試驗主要研究不同的發酵時間（0、12、16、24、32、40、48 h）、固態培養基組成[仔豬配合飼料∶水=（80∶20）、（70∶30）、（60∶40）、（50∶50）]、發酵溫度（25、28、30、32、35 ℃）及接種量（3%、5%、10%、15%、20%）對發酵產品蛋白的影響，其它因素還有培養基的種類（551H與552H），并進行7×2（發酵時間）、4×2（固態培養基組成）、5×2（發酵溫度）及5×2（接種量）試驗設計，每組試驗均重復3次。

1.5.2 優化試驗設計-響應面設計

在研究各種工藝參數影響的基礎上，根據實際應用及統計分析確定每個因素的最高與最低水平，進行4因素的響應面設計，共27組，每組試驗均重復3次。試驗結果進行二次響應面回歸建模，并預測最佳工藝參數。

1.5.3 驗證試驗

在優化試驗確定最佳理論工藝參數的基礎上，并對該工藝參數進行相應的發酵試驗，其結果與理論值進行比較，最終確定最佳工藝參數。

1.6 統計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結果進行多因素方差分析（ANOVA）、最小二乘法（LSD）進行各水平之間的多重比較以及二次響應面回歸分析。

2 結果與討論

2.1 發酵時間對發酵產品蛋白的影響

本研究所選用的是兩種市售仔豬配合飼料，具有較好的代表性，從表1可看出，551H與552H營養及配比各有側重，前者易消化吸收更適合斷奶的仔豬，后者利于腸道健康則更適合年齡更大的仔豬。對此我們分別對兩種配合飼料進行酵母固態發酵研究。通過發酵時間對發酵產品的影響可以發現（圖1），在0～24 h內，兩種配合飼料均隨著發酵時間的延長其蛋白含量及其增加率相應提高，趨勢基本一致；但是，發酵時間達到24 h后，兩種飼料的蛋白所受的影響不同，551H呈“U”形態勢，而552H則呈“倒U”形態勢，具體來說，24～40～48 h，551H 先降后增趨勢，而552H 則與之相反。而通過統計學分析本次試驗結果，發酵時間影響著酵母對于這兩種飼料固態發酵產品的蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1），各水平的多重比較排序為：0 hd、12 hc、16 hbc、24 hab、32 hb、40 hb、48 ha（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中發酵12 h后產品中蛋白含量及其增加率顯著高于未發酵的產品（P＜0.05），但是12～16 h及16～40 h各水平之間的差異并不顯著（P＞0.05），發酵24 h及48 h產品中蛋白指標均有一個明顯的提升（P＜0.05）。因此，結合試驗結果與應用，在后續優化試驗中對于551H，可確定發酵時間的最高水平（24 h）及最低水平（12 h），而對于552H，可確定發酵時間的最高水平（40 h）及最低水平（12 h）。至于發酵原料影響，主要體現在對產品蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P＜0.000 1)的影響非常顯著，且發酵551H 后蛋白的含量及其增加率明顯高于552H（P＜0.05）。

圖1 發酵時間對酵母固態發酵仔豬配合飼料的影響

酵母作為一種兼氧型微生物，在有氧或無氧的條件下均能生長，只是在有氧的條件下生長速度較快。對于本研究，固態發酵前期，由于顆粒間隙的存在，氧分充足，此時酵母好氧發酵占主導，隨著發酵的進行，氧分的逐步消耗，固態顆粒間傳質的不連續性，形成局部“無氧”，好氧發酵逐漸受到限制，厭氧發酵逐步上升。由于前期好氧發酵所代謝的產物及大量微生物的生成與凋亡，必將成為厭氧發酵首選營養物質而被利用（類似于過度發酵），因此，產品中營養指標蛋白含量出現下降，再延長發酵時間，厭氧發酵進程逐步加快，飼料中的營養成分開始成為酵母的主要營養物質來源，產品中蛋白含量出現回升。對于不同品種的仔豬配合飼料，好氧與厭氧發酵的轉化時間點是不一樣的，551H營養組成更利于酵母生長，發酵速度更快，再加上顆粒間隙小、容氧少，導致氧分快速耗盡，較552H先進入厭氧發酵，48 h時，厭氧發酵已進行快速生長期，而552H發酵到48 h時，才進入厭氧發酵期，因此，在所研究的48 h內，酵母固態發酵551H，好氧與厭氧發酵均能有效地進行，而對于552H，只能有效地進行好氧發酵，這樣就導致在產品的蛋白指標上，551H 優于552H。當然，考慮到時間長不利于實際應用成本，兩種飼料在時間上盡量控制在好氧階段。

2.2 固態培養基組成對發酵產品蛋白的影響

研究中所采用的固態培養基由仔豬配合飼料與水組成，那么其中的固液比影響發酵的進程及相應的生產效率與成本。如圖2 所示，兩種培養基中，固液比的大小，影響著發酵產品的蛋白含量及其增加率，但結果二者不同。對于551H 固態培養基，固液比的增加對于發酵的影響呈“N”形逐步向上態勢；而對于552H培養基，呈現出“倒L”形快速上升后趨緩態勢的特點。總的來說，低固液比（如50∶50）可獲得較高的產品品質，而高固液比（如80∶20）則不利于發酵的進行。但是，本次研究中，固態培養基組成對于發酵的產品蛋白含量的影響（P=0.004 3＜0.01）及蛋白增加率的影響（P＜0.000 1）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序：（80∶20）b，（70∶30）a，（60∶40）a，（50∶50）a（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中高固液比（80∶20）對于發酵產品中蛋白含量及其增加率顯著低于其它水平發酵的產品（P＜0.05），但是對于另外三水平之間的水平差異并不顯著（P＞0.05），因此，在后續優化試驗中，結合生產實際，確定固液比最高水平（80∶20=4）及最低水平（60∶40=1.5）。另外，培養基的種類對蛋白含量（P＜0.000 1）有顯著影響，而且發酵551H后蛋白的含量明顯高于552H（P＜0.05）。

圖2 固態培養基組成對酵母固態發酵仔豬配合飼料的影響

酵母必須有水才能存活，但酵母需要的水分比細菌少，對滲透壓有相當高的耐受性。固態培養基中水分的含量影響著各種微生物養分的溶解，從而影響著滲透壓。對于551H，含有大量可溶解的營養成分（表1），水分含量的增加，易溶營養成分增加，滲透壓加大，有利于酵母的吸收利用，因此低固液比（50∶50）有利于該菌種的生長。對于552H，易溶營養組分較少，較高水分含量下，滲透壓基本上變化不大，因此固液比低于（80∶20）下產品蛋白指標變化不大。由上分析可知，兩種培養基的組成決定了酵母固態發酵551H 優于552H。總的來說，鑒于實際應用及試驗結果，固液比可控制在（60∶40）之上。

2.3 發酵溫度對發酵產品蛋白的影響

酵母細胞最適生長溫度一般在20～30 ℃，不能高于47 ℃。圖3表現了兩種飼料在不同發酵溫度下其發酵產品中蛋白的變化，而且對不同飼料，其變化趨勢不同。對于551H，32 ℃較有利于酵母的生長，過高或過低均不利于該菌種生長；而對于552H，28 ℃時發酵產品有較高的蛋白及其增長率。而對所獲得的結果進行統計分析，溫度對該發酵產品蛋白含量（P=0.041 1＜0.05）及其增加率（P=0.022 6＜0.05)均影響顯著，各水平的多重比較排序為：25 ℃abc、28 ℃ab、30 ℃a、32 ℃bc、35 ℃c（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，25～30 ℃之間差異不明顯，且有利于酵母的生長。因此，在后續優化試驗中，結合生產實際，對于551H，確定最高發酵溫度32 ℃及最低發酵溫度25 ℃；而對于552H，確定最高發酵溫度30 ℃及最低發酵溫度25 ℃。至于發酵基的種類，在本次試驗中發現其對于產品蛋白含量（P＜0.000 1)及其增加率（P=0.004 1＜0.01)的影響非常顯著，具體表現在551H發酵后所得產品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但蛋白增加率與之相反。

溫度改變，影響微生物的代謝活動，從而影響微生物的生命活動。溫度的提高，均有利于酵母對于這兩種飼料的發酵，只是影響程度各不相同。前已分析，對于相同溫度與相同發酵時間內，551H 較552H有更高的發酵速度，導致25～28 ℃升溫過程中對于產品蛋白的影響不顯著，而552H則影響明顯；進一步提高溫度，對于551H，酵母生長加速明顯，可利用營養物質充分，產品中蛋白含量增加，到32 ℃，由于酵母的快速生長導致營養快速消耗改變了環境因子，從而抑制發酵進行，不利于產品蛋白指標；至于552H，由于組成與551H 的差異，高于28 ℃，在研究的發酵時間內，營養快速消耗致使過早地抑制發酵的進程。

2.4 接種量對發酵產品蛋白的影響

圖3 發酵溫度對酵母固態發酵仔豬配合飼料的影響

圖4 接種量對酵母固態發酵仔豬配合飼料的影響

如圖4所示，接種量對于酵母固態發酵這兩種仔豬配合飼料的影響趨勢基本一致。試驗發現，較低的接種量（3%～5%）更利于酵母固態發酵仔豬飼料，而增加接種量，551H 發酵產品中蛋白含量及增加率趨于“V”形態，即下降后有所增加，而對于552H，增加接種量后基本趨于穩定。統計分析結果表明，接種對發酵產品中蛋白含量（P=0.004 0＜0.01）及其增加率（P=0.002 5＜0.01）的影響非常顯著，各水平的多重比較排序：3%a、5%b、10%a、15%a、20%a（右上角不同字母表示差異顯著，P＜0.05），其中，接種量3%對于發酵產品中蛋白含量及其增加率顯著高于接種量5%所發酵的產品（P＜0.05），而與其它水平之間的差異并不顯著。因此，在后續優化試驗中，結合生產實際，確定接種量最高水平為10%，最低水平為3%。另外，本次試驗中固態培養基對于產品中蛋白含量（P＜0.000 1）及其增加率（P=0.001 0＜0.01）影響非常顯著，而且551H發酵后所得產品的蛋白含量明顯高于552H（P＜0.05），但是552H發酵后所得產品的蛋白增加率明顯高于551H（P＜0.05）。

本次試驗結果表明，較低的接種量（3%～5%）的情況下，有利于酵母固態發酵仔豬配合飼料，均能獲得較好的發酵效果。由于種子培養液中菌體濃度均達到較高的水平（＞108CPL/ml），以較低接種量接種后應具有較高的分布密度，利于酵母的快速生長。當接種量增加到15%時，高密度的菌種將會過快地消耗飼料中有限的養分，微生物競爭性生長加劇，相同時間內過早地抑制發酵的進程，而厭氧發酵沒有起到主導作用。對于551H，當接種量達到20%時，會出現產品的蛋白指標有所提升，這應該是后期酵母厭氧發酵起到了主導作用。由于551H 與552H 微生物可利用養分及顆粒間透氣性的差異，導致了發酵產品中出現了552H發酵產品具有較高的蛋白增加率，當然，具體機制仍需要進一步研究。

2.5 響應面試驗設計與結果

2.5.1 固態發酵仔豬配合飼料551H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發酵時間12～24 h，固態培養基組成/固液比值1.5～4，發酵溫度25～32 ℃，接種量3%～15%)下，進行如表2 所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統計分析（表3）發現，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I 及二次項T×T、t×t、R×R及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于酵母固態發酵仔豬配合飼料551H 工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數預測，其結果為：發酵時間24 h、固態培養基組成/固液比值2.75、發酵溫度32 ℃、接種量3%，此時有較高的蛋白含量（22.79%）及其增加率（8.78%）。

表2 酵母固態發酵仔豬配合飼料551H響應面設計與結果

表3 酵母固態發酵仔豬配合飼料551H優化試驗統計分析結果

2.5.2 固態發酵仔豬配合飼料552H

在前期確定各種因素的最高與最低水平(發酵時間12～40 h，固態培養基組成/固液比值1.5～4，發酵溫度25～30 ℃，接種量3%～15%)下，進行如表4 所示的響應面試驗。通過對該試驗結果統計分析（表5）發現，在所構造的二次模型中，一次項t、R、T、I及二次項t×t、T×T、R×R 及模型整體均較為顯著（P＜0.01），且模型的失擬項（P＞0.05）不顯著，該模型可在各因素的水平范圍內應用于酵母固態發酵仔豬配合飼料552H工藝。通過擬合并估計出二次響應面回歸模型各顯著項的系數，并進行蛋白含量及增加率最高時的最佳工藝參數預測，其結果為：發酵時間40 h、固態培養基組成/固液比值2.125、發酵溫度27.5 ℃、接種量3%，此時有較高的蛋白含量（21.40%）及其增加率（11.05%）。

表4 酵母固態發酵仔豬配合飼料552H響應面設計與結果

表5 酵母固態發酵仔豬配合飼料552H優化試驗統計分析結果

表6 驗證試驗及統計分析結果

2.5.3 驗證試驗

為了進一步檢驗經過響應面設計試驗所獲得的模型及其預測的最佳工藝條件的可靠性，在最佳工藝條件進行驗證試驗，并重復5 次，結果及統計分析如表6所示：對于酵母固態發酵551H及552H，驗證試驗結果與預測結果差異性均不顯著（P＞0.05）,因此，模型預測的最佳工藝參數適合實際應用。

3 結論

對于酵母固態發酵仔豬配合飼料551H 及552H的發酵時間、固態培養基組成/固液比值、發酵溫度、接種量等工藝參數進行了系統地研究，得到如下結論：

①在前期各因素對于固態發酵的影響試驗中，發酵時間、固態培養基組成、發酵溫度、接種量以及固態培養基的種類顯著影響著酵母對于這兩種飼料固態發酵產品的蛋白含量及其增加率。

②對于固態發酵551H，確定各種因素的最高與最低水平為發酵時間12～24 h、固態培養基組成/固液比值1.5～4、發酵溫度25～32 ℃、接種量3%～15%；對于固態發酵552H，確定各種因素的最高與最低水平為發酵時間12～40 h，固態培養基組成/固液比值1.5～4，發酵溫度25～30 ℃，接種量3%～15%。

③通過響應面試驗設計統計分析得到可靠性較高的二次響應面回歸模型，并預測最佳工藝參數：對于固態發酵551H，發酵時間24 h，固態培養基組成/固液比值2.75，發酵溫度32 ℃，接種量3%；對于固態發酵552H，發酵時間40 h，固態培養基組成/固液比值2.125，發酵溫度27.5 ℃，接種量3%，驗證試驗證明該參數可行。

因此，該研究結果將為工業化酵母固態發酵仔豬配合飼料的工藝提供試驗與理論支撐，但是仍需要進行放大試驗、中試等進一步研究，以更好地應用實際生產。