浙貝母原產地及其遷地引種后含量分析

雨 田， 練心潔， 孫佑玲， 劉 鳳， 張艷容， 周 濃

(1.成都大學 醫學院， 四川 成都 610106； 2.成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106；3.重慶三峽學院 生物與食品工程學院， 重慶 404000)

0 引 言

浙貝母為百合科貝母屬植物，以其干燥鱗莖入藥，是浙江道地藥材，主要功效為止咳祛痰，在眾多治療咳嗽的方劑及中成藥中廣泛使用[1-2].目前，野生浙貝母僅分布于浙江，而人工栽培品種除浙江外，在江蘇、上海及福建等地也有種植[3-4].浙貝母生長習性喜濕忌旱、澇，對土質有較嚴格的要求，且土質、水分、溫度和光照等因素均可能對浙貝母生長產生影響，進而決定浙貝母的品質和產量[5-6].對此，本研究采集了浙江東陽等7個原產地的浙貝母，并在重慶地區進行栽培，對其進行貝母素甲、貝母素乙、貝母辛及總生物堿等有效成分的含量測定及差異分析，并基于有效成分含量測定結果篩選出適合重慶地區栽培的浙貝母種源.

1 材料儀器

1.1 材料與試劑

1)實驗所用浙貝母于2014年5月期間采自浙江省東陽市千祥鎮東王村等7個種植基地，所有樣品經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母的鱗莖(見表1).

2)實驗所用試劑包括：貝母素甲對照品(批號，B20080)、貝母素乙對照品(批號，B20081)、貝母辛對照品(批號，B20082)，購自上海源葉生物科技有限公司，乙腈色譜純(美國Fiser公司)；甲醇(批號，M813895)、三氯甲烷(批號，B139244)，購自天津恒興化學試劑公司，水為娃哈哈牌純凈水，其余試劑均為分析純.

表1樣品來源

No.采集地經緯度海拔/m采集日期S1浙江省東陽市千祥鎮東王村120°06′49″/29°01′57″1692014.05.14S2浙江省磐安縣尚湖鎮小坑門村120°38′24″/29°06′58″4862014.05.15S3浙江省磐安縣仁川鎮方山村120°42′55″/28°89′59″5022014.05.14S4浙江省磐安縣新渥鎮古竹村120°23′27″/28°57′02″3502014.05.13S5浙江省磐安縣仁川鎮半坑村120°26′27″/28°53′11″5412014.05.15S6安徽省蕪湖縣花橋鎮苗育村118°37′02″/31°15′13″1 4002014.05.11S7江蘇省通州區張芝鎮啟橋村121°01′17″/31°56′27″142014.05.08

1.2 儀器與設備

實驗所用儀器包括：LC-20D型高效液相色譜儀(島津公司)；KH-5205D型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)；CP-224C型分析天平(奧豪斯儀器有限公司).

2 方 法

2.1 浙貝母總生物堿的測定

2.1.1 對照品溶液制備.

取貝母素甲對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.4 mg貝母素甲的溶液，制得對照品溶液.

2.1.2 供試品溶液制備.

取本品干燥粉末(過六號篩)約2 g， 精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入濃氨試液4 mL浸泡1 h，精密加入三氯甲烷—甲醇(4∶1)混合溶液50 mL，稱定質量，于85 ℃水浴中加熱回流2 h，取出，自然冷卻至室溫，補足減失的質量，濾過.精密量取續濾液25 mL，置蒸發皿中水浴揮干，殘渣加少量甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.1.3 標準曲線的繪制.

分別精密量取“2.1.1”項下對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，水浴揮干，精密加入鄰苯二甲酸氫鉀—氫氧化鈉緩沖液(pH值5.0)5 mL、顯色劑溶液4 mL，振搖混勻，再精密加入三氯甲烷15 mL，振搖后轉移至分液漏斗中，靜置1 h.以三氯甲烷試劑為空白，在410 nm波長處測定吸光度，以吸光度值(A)為縱坐標，貝母素甲濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為，A=0.0353C-0.0537(r=0.9994).結果表明，貝母素甲對照品在4.0～28.0 μg/mL范圍內線性關系良好.

2.1.4 樣品含量測定.

精密量取“2.1.2”項下供試品溶液1.0～3.0 mL，置50 mL錐形瓶中，水浴揮干溶劑，按照“2.3.1”項下，自“精密加入鄰苯二甲酸氫鉀—氫氧化鈉緩沖液(pH值5.0)5 mL”起，依法測定吸光度，代入標準曲線計算供試品中貝母素甲的質量(mg).本品總生物堿含量以貝母素甲計算[7]，結果見表2.

表2 浙貝母原產地及其遷地引種后浙貝母總生物堿含量(mg/g)

注：*為顯著(P<0.05)；**為高度顯著(P<0.01).

2.2 浙貝母生物堿的測定

2.2.1 色譜條件.

實驗的色譜柱條件為：色譜柱為Durashell C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為A相(乙腈)、B相(0.01 %三乙胺水溶液)；梯度洗脫(0～10 min，30% A，10～15 min，30% A→38% A，15～25 min，38% A→60% A，25～35 min，60% A，35～50 min，60% A→70% A，50～70 min，70% A→90% A)；漂移管溫度57 ℃；載氣流速2.0 L/min；體積流量1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃.

按照上述色譜條件進行分析，各組分分離度良好，對照品和供試品的HPLC色譜圖如圖1所示.

1.貝母辛； 2.貝母素甲； 3.貝母素乙

圖1混合對照品(A)和供試品(B)HPLC圖

2.2.2 對照品溶液的制備.

分別精密稱取貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對照品適量，溶解于甲醇，制成一定濃度的對照品溶液，備用.

2.2.3 供試品溶液的制備.

精密吸取“2.1.2"項下的供試品溶液10 mL，置蒸發皿中水浴揮干溶劑，殘渣加甲醇適量使其溶解，并轉移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.2.4 線性關系考察.

精密稱取貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對照品適量，溶于甲醇，制成每1 mL分別含貝母素甲0.412 mg、貝母素乙0.304 mg和貝母辛0.452 mg的混合溶液.精密量取此混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品質量(X)為橫坐標，進行線性回歸，計算得到貝母素甲、貝母素乙、貝母辛的回歸方程分別為:Y=332 543X-365 852(r=0.9996)、Y=207 718X-186 154(r=0.9998)、Y=178 449X-182 918(r=0.9995)，線性范圍分別為0.103～0.412 μg/μL、0.076～0.304 μg/μL、0.113～0.452 μg/μL.

2.2.5 樣品含量測定.

取浙貝母原產地及其遷地引種后浙貝母藥材樣品粉末，按“2.2.3"項下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，用標準曲線法分別計算各樣品中貝母素甲、貝母素乙、貝母辛的含量，結果見表3.

表3 浙貝母原產地及其遷地引種后浙貝母生物堿含量(mg/g)

2.3 結果與分析

1)由浙貝母樣品總生物堿含量測定結果及方差分析可知，不同地區栽培的浙貝母中總生物堿含量存在較大的差異，此結果與尹尚軍[7]、陳梅梅等[8]的報道相似.浙江東陽(S1)、尚湖小坑門(S2)、仁川方山(S3)、新渥古竹(S4)、安徽花橋(S6)等5地浙貝母經遷地引種后，其總生物堿含量顯著上升，其余兩地浙貝母該成分含量引種前后未有較大變化.浙貝母總生物堿含量經遷地引種后總體呈上升趨勢，證明浙貝母引種后，其主要有效成分與引種前相比，保持穩定或有所增高，該結論是浙貝母引種至重慶地區的重要實驗依據.

2)由浙貝母原產地及其遷地引種后浙貝母樣品生物堿含量測定結果可知，各地浙貝母引種后生物堿含量與引種前相比均具有差異.仁川半坑(S5)浙貝母經遷地引種后，其貝母素甲和貝母素乙含量分別為0.65%和0.23%，對比引種前分別升高48.65%和28.71%.安徽花橋(S6)的浙貝母經遷地引種后貝母素甲和貝母素乙含量分別為1.47%和0.31%，對比引種前升高502.37%和39.76%.上述兩種引種后的浙貝母中生物堿含量均符合《中國藥典》(2015年版一部)浙貝母藥材項下“含量測定”的限定標準(貝母素甲和貝母素乙的總量不低于0.080%)[1].新渥古竹(S4)地區浙貝母的生物堿含量降低，其總生物堿含量卻在上升，這可能與浙貝母中其他生物堿類成分的含量有關，但具體的生物堿種類還有待進一步研究.安徽花橋(S6)浙貝母引種后，總生物堿含量為7個地區最高，且高于浙貝母道地產區浙江，其原因可能與其當地的氣候條件、土質和海拔有關[9].但對于總生物堿與單類生物堿成分含量變化的不統一，其內在原因還有待研究.

3 結 論

通過對浙貝母原產地及其遷地引種后的含量分析可知，浙貝母經遷地引種至重慶地區后，其指標性成分(生物堿類成分)具有較大的差異，其中仁川半坑(S5)、安徽花橋(S6)兩地的浙貝母經遷地栽培后該成分顯著上升，可引種至重慶地區栽培.本研究結論為浙貝母在重慶地區的引種栽培提供了相關的實驗數據.