柄藍(lán)狀菌原生質(zhì)體的制備與再生條件優(yōu)化

張薈蓉，周志義，耿安利

1.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；3.新加坡義安理工學(xué)院，新加坡 999002

近年來，絲狀真菌在工業(yè)酶方面的研究得到了廣泛應(yīng)用。柄藍(lán)狀菌EMM是絲狀真菌中一株經(jīng)過誘變的高產(chǎn)纖維素酶菌株，是由本實(shí)驗室自主分離得到，其纖維素與半纖維素的產(chǎn)量已經(jīng)可以達(dá)到工業(yè)水平［1］。為了更進(jìn)一步提高纖維素酶的產(chǎn)量，從分子水平上分析菌株的特性，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立成為其研究的第一步［2］。相比于其他受體的轉(zhuǎn)化體系，絲狀真菌因為存在細(xì)胞壁，會導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化時外源基因很難進(jìn)入［3］。針對絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法主要有PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化［4-5］，電擊轉(zhuǎn)化［6-7］，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化［8-9］，基因槍轉(zhuǎn)化［10］，限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化［11］，其中PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是現(xiàn)在絲狀真菌使用最多的轉(zhuǎn)化方法［12］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法雖然受體形式多樣，轉(zhuǎn)化效率高，但其在轉(zhuǎn)化過程中會在轉(zhuǎn)化體系中引入外源片段［13］，并且操作復(fù)雜，周期長，轉(zhuǎn)過過程容易受影響［14］。PEG/CaCl2原生質(zhì)體方法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，整合度高，并且容易得到多拷貝而成為常用的轉(zhuǎn)化方法［15］。常見的真菌黑曲霉［16］、紅曲霉［17］，Trichoderma viride［18］和絲狀真菌AL18［19］等均采用原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，已經(jīng)建立了良好的轉(zhuǎn)化體系。PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，足夠數(shù)量且再生能力強(qiáng)的原生質(zhì)體的制備是最為重要的部分［20-21］。因不同真菌的細(xì)胞壁構(gòu)造不同，裂解收集原生質(zhì)體的方式也會不同，因此不同菌種中制備原生質(zhì)體的方法也需要不斷地探索優(yōu)化。……