山東省部分地區(qū)豬源大腸桿菌毒力基因檢測試驗(yàn)

李春蕾

（山東省煙臺市動物疫病預(yù)防與控制中心，煙臺 264003）

0 引言

大腸桿菌是人畜腸道內(nèi)一種常見的菌株，1988年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大腸桿菌時，認(rèn)為其為非致病性菌株。20世紀(jì)中期，部分學(xué)者認(rèn)識到一些血清型特殊的大腸埃希菌具有致病性，特別對嬰幼兒和幼畜危害巨大。致病性大腸桿菌是引起多種疾病的萬惡之首，常使人畜出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，如仔豬紅白痢等。同時，引起仔豬水腫病、敗血癥以及影響畜禽生長發(fā)育等，造成畜禽的生產(chǎn)能力低下，嚴(yán)重者甚至造成大量的死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。致病性大腸埃希菌具有廣泛的傳播性，其通過食物、水源以及空氣等經(jīng)質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移等方式進(jìn)行傳播，進(jìn)而引發(fā)疫情，給畜牧業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴(yán)重威脅[1]。大量研究表明，致病菌的致病機(jī)理與毒力基因有關(guān)[2]。不同來源和不同基因背景的菌株的毒力基因分布存在顯著的差異[3]。研究以山東地區(qū)送檢病料分離的致病性大腸桿菌為例，分析山東地區(qū)分離的致病性大腸桿菌攜帶毒力基因情況，探究毒力基因分布差異情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株。試驗(yàn)菌株來源于2013—2015年從山東省不同地區(qū)養(yǎng)殖場采集患病豬內(nèi)臟。ATCC25922藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)株由實(shí)驗(yàn)室保存。

（2）培養(yǎng)基及試劑。麥康凱培養(yǎng)基（購自北京陸橋技術(shù)有限公司），PCRbuffer、dNTP和TaqDNA聚合酶均購于天根生化科技（北京）有限公司；DL5 000 DNA Marker購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌分離鑒定

將山東省不同地區(qū)送檢病料樣品于麥康凱培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個玫紅色可疑菌落，接種于非選擇性MHA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落采用水煮法提取DNA，進(jìn)行16sPCR擴(kuò)增，然后測序。通過pubmed-blast比對，將鑒定為陽性的大腸桿菌保存于30%的甘油肉湯中，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大腸桿菌DNA提取

將分離鑒定的大腸桿菌接種影響瓊脂，37 ℃培養(yǎng)14 h，挑取單一菌落加入到100μL滅菌雙蒸水中，100 ℃煮沸10 min，冰浴10 min，離心機(jī)12 000 rpm離心2 min，取上清，備用。

1.2.3 毒力基因檢測

宋彬[4]等試驗(yàn)研究中設(shè)計合成的引物（見表1），由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。

表1 大腸桿菌毒力基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌分離鑒定

山東地區(qū)送檢樣品經(jīng)培養(yǎng)基篩選，16SrRNA PCR凝膠電泳和測序鑒定見圖1，最終確定共獲得大腸桿菌205株。

圖1 16SrRNA凝膠電泳圖

2.2 大腸桿菌毒力基因檢測

通過PCR檢測擴(kuò)增毒力基因攜帶情況 ，發(fā)現(xiàn)sitA攜帶率最高，達(dá)66.82%；其次是fimC ，攜帶率高達(dá)65.85%；而eaeA攜帶率最低為0.98%。多個毒力基因的檢測表明，山東地區(qū)送檢病料分離大腸桿菌攜帶毒力基因陽性率高，部分檢測結(jié)果見圖2、圖3、圖4。

圖2 fimC毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

圖3 sitA毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 部分hlyF、iss、papC、iucD、irp2毒力基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

大腸桿菌致病性的主要原因是產(chǎn)生各種毒力因子，不同大腸桿菌的致病性的產(chǎn)生主要與其攜帶的不同的毒力基因有關(guān)，研究從送檢病料分離的菌株共205株，共檢測發(fā)現(xiàn)8個毒力基因，其中各種毒力基因的攜帶情況各不統(tǒng)一，其中攜帶毒力基因最多的為sitA和fimC，而其中fimC是高致病力菌株的標(biāo)致基因，大量毒力基因攜帶和傳播是致病性大腸桿菌防控的主要難點(diǎn)[5]。有不同的研究人員通過探究大腸桿菌的毒力基因以及血清型分析大腸桿菌的致病性，不少專家認(rèn)為質(zhì)粒具有傳遞性，當(dāng)致病性大腸桿菌的質(zhì)粒上攜帶大量毒力基因時，增加了傳遞的風(fēng)險和危害，同時給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)風(fēng)險[6]。大量不同的研究方法發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌攜帶大量毒力基因影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展[7]。

4 結(jié)束語

研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)送檢病料分離的大腸桿菌中攜帶大量毒力基因，應(yīng)引起畜牧養(yǎng)殖戶的高度重視。