正五聚蛋白3在急性冠狀動(dòng)脈綜合征合并抑郁癥診斷及治療中的意義Δ

陳松海，劉秋瓊，林秋曉，李廣華，黃 革（廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥劑科，廣州 510080）

急性冠狀動(dòng)脈綜合征（ACS）是一種病死率較高的常見(jiàn)心血管急癥，其發(fā)病及預(yù)后除與生物因素有關(guān)外，還與患者的個(gè)體情緒有關(guān)[1]。相關(guān)研究表明，抑郁癥是ACS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響ACS患者的預(yù)后[2]。ACS常伴隨著炎癥因子[如白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等]的急速釋放[3-4]，導(dǎo)致血腦屏障受到破壞[5]，使得上述炎癥因子進(jìn)入大腦，引發(fā)神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致抑郁癥狀的出現(xiàn)[6-7]。研究指出，抑郁癥患者同時(shí)也存在炎癥因子水平升高的情況[8-9]。由此可見(jiàn)，炎癥因子在ACS與抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中具有重要的連接作用。因此，深入探討ACS合并抑郁癥患者體內(nèi)相關(guān)炎癥因子含量的變化，可能成為其臨床治療的突破口。

正五聚蛋白3（PTX-3）作為急性期炎癥反應(yīng)蛋白，能夠直接反映血管病變的炎癥狀態(tài)[10]。近年來(lái)，PTX-3被認(rèn)為是ACS的生物標(biāo)志物，其含量可反映ACS的炎癥嚴(yán)重程度[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PTX-3在慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（CUMS）抑郁癥模型大鼠血漿中的表達(dá)水平顯著升高，可將其作為抑郁程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[12]；亦有臨床研究證實(shí)，抑郁癥患者外周血中PTX-3 mRNA的表達(dá)水平異常升高[13]。因此，本課題組推測(cè)PTX-3可作為ACS合并抑郁癥診斷及治療中的考察指標(biāo)。鑒于目前未見(jiàn)探討PTX-3與ACS合并抑郁癥相關(guān)性的報(bào)道，本研究在現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，采用回顧性研究方法，探討ACS或抑郁癥、ACS合并抑郁癥患者體內(nèi)PTX-3的表達(dá)差異，旨在進(jìn)一步明確PTX-3能否成為ACS合并抑郁癥診斷的早期生物標(biāo)志物；同時(shí)，考察經(jīng)不同藥物治療后上述患者體內(nèi)PTX-3表達(dá)水平的變化情況，以期為臨床考察指標(biāo)的選擇和治療方法的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；Megafuge 2.0R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；THM51119300型全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀、TCA4848型梯度聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀、Nano Drop 2000型超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸舍曲林片（輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10980141，批號(hào)：W09036，規(guī)格：50 mg）；逍遙丸[廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020869，批號(hào)：150602，規(guī)格：丸劑（水丸）]；阿司匹林腸溶片（德國(guó)Bayer Vital GmbH公司，注冊(cè)證號(hào)：H20130339，批號(hào)：20150821，規(guī)格：100 mg）；通心絡(luò)膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19980015，批號(hào)：A1508019，規(guī)格：每粒裝0.26 g）。

人外周血單核細(xì)胞分離試劑盒（含試劑A、試劑D、清洗液等試劑，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：90151103）；PTX-3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：P18012809）；RNA提取試劑（批號(hào)：AKA5601）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AK4901）、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（含SYBR熒光染料、去RNA酶滅菌水等試劑，批號(hào)：AHX1018N）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：WXBB3108）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國(guó) HyClone公司，pH＝7.4，批號(hào)：AC11223329）；甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH，實(shí)驗(yàn)室自制）；氯仿、乙醇、異丙醇等均為分析純，水為超純水。

2 資料與方法

2.1 研究對(duì)象

2.1.1 ACS組 選取我院2015年12月－2018年3月收治的ACS住院患者作為ACS組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》[14]中ACS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）、非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）、ST段抬高型心肌梗死（STEMI）。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心力衰竭、急性腦卒中者；肺部感染、慢性阻塞性肺疾病者；重癥肝炎、肝腎功能衰竭者；甲狀腺功能亢進(jìn)者；心肌炎、肥厚性心肌病者；結(jié)締組織病患者；血液病患者；其他感染及壞死性疾病患者；惡性腫瘤患者；妊娠期或哺乳期婦女。該組共納入ACS患者84例。

2.1.2 抑郁癥組 選取我院同期收治的抑郁癥住院患者作為抑郁癥組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)精神疾病分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版（精神障礙分類）》[15]中抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，漢密爾頓抑郁量表（HAMD）評(píng)分≥20分[16]。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期或哺乳期婦女；具有器質(zhì)性精神障礙或者由精神活性物質(zhì)所致的精神障礙者；嚴(yán)重心、肝、腎等實(shí)質(zhì)性臟器損害者；神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病患者；語(yǔ)言聽(tīng)力功能障礙者。該組共納入抑郁癥患者85例。

2.1.3 ACS合并抑郁癥組 選取我院同期收治的ACS合并抑郁癥住院患者作為ACS合并抑郁癥組，納入與排除標(biāo)準(zhǔn)同“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)。該組共納入ACS合并抑郁癥患者80例，根據(jù)患者治療方法的不同又分為化學(xué)藥治療組（40例）和中成藥治療組（40例）。

2.1.4 對(duì)照組 選取同期于我院進(jìn)行體檢的健康受試者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②無(wú)腫瘤標(biāo)志物和鐵蛋白增高等肺癌相關(guān)高危因素[17]；③常規(guī)體檢及肝腎功能無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①依從性差，不愿意加入本研究者；②研究者認(rèn)為不適宜的其他情況。該組共納入受試者90例。

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。各組受試者的年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 治療方法

2.2.1 ACS組 ACS組患者接受阿司匹林腸溶片（50～150 mg/次，qd）+通心絡(luò)膠囊（2～4粒/次，tid）連續(xù)治療4周。

2.2.2 抑郁癥組 抑郁癥組患者接受鹽酸舍曲林片（50 mg/次，qd）+逍遙丸（9 g/次，bid）連續(xù)治療4周。

2.2.3 ACS合并抑郁癥組 化學(xué)藥治療組患者接受阿司匹林腸溶片+鹽酸舍曲林片治療，中成藥治療組患者接受通心絡(luò)膠囊+逍遙丸治療，用法用量同“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)。

2.3 PTX-3含量的測(cè)定

所有受試者分別于治療前后晨起空腹抽取靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。取一半靜脈血以2 500 r/min離心10 min，收集上層血漿，采用ELISA法以全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算其中PTX-3的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。另一半血樣用于測(cè)定PTX-3 mRNA的表達(dá)水平。

2.4 PTX-3 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

2.4.1 外周血單核細(xì)胞分離 嚴(yán)格按人外周血單核細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取15 mL離心管，依次加入總體積與血漿樣品等同的試劑A、試劑D（體積比為3∶2），隨后加入血漿樣品適量，以2 700 r/min離心30 min。吸取細(xì)胞層至另一15 mL離心管中，加入清洗液10 mL，混勻，以1 900 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀以清洗液5 mL重懸，以2 700 r/min離心10 min后，用清洗液清洗3次，每次5 mL，棄去上清液，即得外周血單核細(xì)胞樣品。然后加入RNA提取試劑0.5 mL，于－80℃凍存，備用。

2.4.2 總RNA的提取 將“2.4.1”項(xiàng)下所得單核細(xì)胞樣品于室溫下放置，混勻，于室溫下靜置10 min，加入氯仿100 μL，混勻，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min。吸取上層水相至另一1.5 mL離心管中，加入3倍體積的異丙醇（4℃預(yù)冷）混勻，于4℃靜置20 min，以15 000 r/min離心15 min以沉淀RNA。吸棄上清液，沉淀用75%乙醇200 μL清洗1次，以15 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入滅菌水（含0.1%DEPC）20 μL以溶解RNA，于－80℃凍存，備用。

2.4.3 PTX-3 mRNA表達(dá)水平的測(cè)定 采用RT-PCR法以熒光定量PCR儀測(cè)定所有受試者單核細(xì)胞中PTX-3 mRNA的表達(dá)水平。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以梯度PCR儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的基因表達(dá)序列，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物（序列見(jiàn)表1）。PCR反應(yīng)體系（總體積為25 μL）：含2×SYBR熒光染料12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA2 μL，去RNA酶滅菌水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用熔解曲線評(píng)估PCR反應(yīng)結(jié)果（熔解曲線峰形單一則表明特異性良好）。以GAPDH為內(nèi)參，以對(duì)照組受試者血漿為對(duì)照樣本，按2－ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt＝ΔCt待測(cè)樣本－ΔCt對(duì)照樣本（其中，ΔCt＝Ct目標(biāo)基因－Ct內(nèi)參基因；Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2.5 療效及安全性評(píng)價(jià)

2.5.1 療效評(píng)價(jià) 通過(guò)12導(dǎo)聯(lián)心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖等觀察ACS患者治療前后ST-T段改變以及心絞痛、室性心律失常、室性心動(dòng)過(guò)速、心室顫動(dòng)、心力衰竭、心肌梗死、心源性猝死等的發(fā)生情況，并按以下標(biāo)準(zhǔn)判定心血管癥狀療效——顯效：患者上述癥狀明顯改善；有效：癥狀有所改善；無(wú)效：癥狀無(wú)明顯改善或惡化；總有效＝顯效+有效[14]。采用HAMD量表評(píng)價(jià)抑郁癥患者治療前后的抑郁癥狀，計(jì)算其HAMD評(píng)分減分率[減分率（%）＝（治療前總分－治療后總分）/治療前總分×100%]，并按以下標(biāo)準(zhǔn)判定抑郁癥狀療效——顯效：精神癥狀基本消失，HAMD評(píng)分減分率≥50%；有效：精神癥狀減輕并有緩解，HAMD評(píng)分減分率≥25%；無(wú)效：精神癥狀無(wú)明顯改善或加重，HAMD評(píng)分減分率＜25%；總有效＝顯效+有效[15-16]。

2.5.2 安全性評(píng)價(jià) 記錄所有患者治療前后肝功能、腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，并觀察其不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組受試者治療前血漿PTX-3含量及mRNA表達(dá)水平比較

治療前，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥組患者血漿PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，且ACS合并抑郁癥組顯著高于ACS組、抑郁癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)表2。

表2 各組受試者治療前血漿PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Tab 2 Comparison of plasma contents of PTX-3 and its mRNA expression in each group before treatment（x±s）

3.2 各組患者治療前后血漿PTX-3含量及mRNA表達(dá)水平比較

治療后，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥化學(xué)藥治療組和中成藥治療組患者血漿PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量均較治療前顯著下降，且ACS合并抑郁癥化學(xué)藥治療組患者上述指標(biāo)治療前后的差值顯著高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而其他各組上述指標(biāo)治療前后的差值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表3、表4。

表3 各組患者治療前后血漿PTX-3含量比較（x±s）Tab 3 Comparison of plasma contents of PTX-3 in each group before and after treatment（x±s）

3.3 各組患者療效與安全性比較

ACS組、ACS合并抑郁癥化學(xué)藥治療組和中成藥治療組患者經(jīng)相應(yīng)藥物治療后，心血管癥狀均有不同程度的改善，其總有效率分別為80.9%、77.5%、72.5%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表5。

抑郁癥組、ACS合并抑郁癥化學(xué)藥治療組和中成藥治療組患者經(jīng)相應(yīng)藥物治療后，抑郁癥狀均有不同程度的改善，其總有效率分別為84.7%、82.5%、77.5%，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表6。

表4 各組患者治療前后血漿PTX-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Tab 4 Comparison of relative expression of PTX-3 mRNA in plasma in each group before and after treatment（x±s）

表5 各組患者心血管癥狀療效比較[例（%%）]Tab 5 Comparison of therapeutic efficacies of cardiovascular symptoms in each group[case（%%）]

表6 各組患者抑郁癥狀療效比較[例（%%）]Tab 6 Comparison of the therapeutic efficacies of depression symptoms in each group[case（%%）]

ACS合并抑郁癥中成藥治療組中有3例患者服用通心絡(luò)膠囊后出現(xiàn)輕微胃腸道不適，經(jīng)停藥后癥狀好轉(zhuǎn)；除此之外，其余患者均未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)發(fā)生。

4 討論

4.1 PTX-3為ACS合并抑郁癥的關(guān)鍵因子

ACS是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破潰、繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的臨床綜合征，包括UAP、NSTEMI、STEMI等類型，其不穩(wěn)定斑塊破裂和隨之發(fā)生的血小板聚集及血栓形成是導(dǎo)致患者發(fā)病的主要機(jī)制[18]。近年來(lái)有研究指出，冠狀動(dòng)脈炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定方面起著重要作用[19]。ACS不僅可給患者造成嚴(yán)重的身體痛苦，而且還可造成重大的精神刺激，以焦慮和抑郁最為常見(jiàn)[20]。而這些情緒障礙均可促發(fā)或加重心絞痛、心肌梗死、心律失常、心力衰竭等癥狀，甚至可導(dǎo)致患者死亡[21]。

PTX-3可直接反映血管的炎癥狀態(tài)，是ACS的診斷指標(biāo)之一[11，22]。目前關(guān)于PTX-3與抑郁癥相關(guān)性的報(bào)道較少，特別是ACS合并抑郁癥方面尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組受試者比較，ACS組、抑郁癥組、ACS合并抑郁癥組患者治療前血漿PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示PTX-3可能參與上述疾病的發(fā)生與發(fā)展。此外，本研究結(jié)果還顯示，ACS合并抑郁癥組患者上述指標(biāo)水平均顯著高于ACS組、抑郁癥組。筆者分析其原因可能為：ACS為一種炎癥疾病，機(jī)體炎癥反應(yīng)可誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，并且炎癥因子也可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞而增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致與抑郁相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞受到損傷[23]，與此同時(shí)，隨著血管炎癥反應(yīng)的加劇，PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量相應(yīng)升高。

4.2 藥物治療對(duì)PTX-3表達(dá)的影響

抗血小板藥物能夠有效降低患者心血管事件的發(fā)生率。阿司匹林對(duì)血小板聚集有抑制作用，可阻止血栓形成；通心絡(luò)膠囊是純中藥制劑，具有益氣活血、通絡(luò)止痛的功效；兩者均具有良好的抗血小板作用，可用于ACS的臨床治療[24-25]，兩者聯(lián)用可有助于抑制患者動(dòng)脈粥樣硬化、減少炎癥反應(yīng)、減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[26-27]。鹽酸舍曲林是一種新型抗抑郁藥，可用于治療抑郁癥和焦慮障礙，具有療效顯著、安全性好、耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[28]；逍遙丸為中醫(yī)經(jīng)典方劑，含柴胡、當(dāng)歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、薄荷等藥材，具有疏肝解郁的功效，是臨床用于肝郁病癥治療的首選中成藥[29]；兩者聯(lián)用能夠快速、有效地改善患者的抑郁癥狀[30]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)4周治療后，各方案對(duì)患者心血管及抑郁癥狀均具有一定的治療效果，且安全性均較高。阿司匹林腸溶片、通心絡(luò)膠囊能顯著降低ACS患者血漿PTX-3含量，鹽酸舍曲林片、逍遙丸能顯著降低抑郁癥患者血漿PTX-3含量。筆者推測(cè)上述藥物對(duì)ACS、抑郁癥的治療作用可能與下調(diào)患者體內(nèi)PTX-3表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。此外，與ACS合并抑郁癥中成藥（逍遙丸+通心絡(luò)膠囊）治療組比較，ACS合并抑郁癥化學(xué)藥（鹽酸舍曲林片+阿司匹林腸溶片）治療組患者體內(nèi)PTX-3含量及mRNA相對(duì)表達(dá)量均有更顯著的改善（以上述指標(biāo)治療前后的差值進(jìn)行衡量）。筆者認(rèn)為這可能與本研究周期較短而化學(xué)藥起效較中成藥更快[31]有關(guān)。

綜上所述，ACS、抑郁癥、ACS合并抑郁癥患者體內(nèi)PTX-3的表達(dá)均較健康受試者更高；藥物治療均可顯著降低上述患者體內(nèi)PTX-3的表達(dá)水平，且化學(xué)藥的作用在短期內(nèi)更明顯。因此，PTX-3可作為ACS合并抑郁癥診斷及治療的生物標(biāo)志物。但由于本研究收集的臨床資料不夠全面，同時(shí)缺乏臨床治療指標(biāo)與PTX-3表達(dá)之間的相關(guān)性分析，故本研究結(jié)論仍有待進(jìn)一步確證。