苗藥八角楓水提液對CIA模型大鼠血清IL-1β、TNF-α水平及滑膜OPG/RANKL/RANK系統的影響Δ

江勇，梁子聰，陳其寬，覃建鋒，張慶忠，王恒

（1.黔南布依族苗族自治州中醫醫院骨傷科，貴州 都勻 558000；2.黔南民族醫學高等專科學校醫學基礎部，貴州 都勻 558000）

八角楓[Alangium（Lour.）Harms.]又名白龍須、八角金盤等，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》（2003年版），為貴州地區苗族特色藥[1]。八角楓廣泛分布于貴州各地，以野生為主，四季皆可采挖，具有祛風通絡、散瘀鎮痛等作用，是當地少數民族治療風濕疼痛、關節麻木、癱瘓、勞損腰痛、跌打損傷等疾病的常用藥物[1]。

類風濕關節炎（RA）是一種系統性的慢性自身免疫性疾病，其特征是全身多關節炎癥反應、漸進性關節軟骨退變及骨破壞。有研究報道稱，以八角楓水煎液熏洗可明顯改善RA患者的臨床癥狀及體征[2]。近年來有研究發現，骨保護素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）系統與RA發展進程中的關節軟骨退變及骨破壞密切相關[3]。鑒于此，本研究通過建立Ⅱ型膠原誘發關節炎（CIA）大鼠模型，初步探討八角楓水提液對其血清白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平以及滑膜OPG/RANKL/RANK系統的影響，以期為八角楓治療RA提供基礎實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

ASP300S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉式切片機、DM750型光學顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan GO型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5427R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；DDIL-5型恒溫箱（上海安亭科學儀器廠）；Jeldoc2000型凝膠影像分析儀（美國Bio-Rad公司）；TPersonal型聚合酶鏈反應（PCR）儀（德國Biometra公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

八角楓藥材購自貴州中藥材貿易公司（批號：20120322），由貴陽中醫學院胡建山教授鑒定為八角楓[A.（Lour.）Harms.]的干燥細須根。

雷公藤多苷片（上海復旦復華藥業有限公司，批準文號：國藥準字Z31020415，批號：130301，規格：10 mg）；弗氏完全佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白（美國Chondrex公司，批號分別為7002、20022）；Trizol試劑盒（美國Invirogen公司，批號：00374923）；SYBR?Select Master Mix預混液（美國ABI公司，批號：C0521A）；Prime Script 1st Strand cDNASynthesis Kit逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號：RR036A）；OPG、RANKL、RANK、β-肌動蛋白（β-actin）的mRNA引物序列設計及合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；IL-1β、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20130305、20130407）；蘇木精-伊紅（HE）染液、乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液、4%多聚甲醛均由黔南民族醫學高等專科學校病理學教研室提供；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級雄性SD大鼠60只，5周齡，體質量140～180 g，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0003]。所有大鼠均適應性飼養1周后開始后續實驗。

2 方法

2.1 八角楓水提液的制備

稱取八角楓藥材適量，烘干、磨粉，加水1 000 mL煎煮3 h，濾過；再加水600 mL煎煮2 h，濾過；合并兩次濾液，濃縮，得質量濃度為1 g/mL（按生藥量計）的八角楓水提液。

2.2 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（雷公藤多苷片，10 mg/kg，參照Meeh-Rubner公式[4]換算而得；以蒸餾水為溶劑）和八角楓水提液低、中、高劑量組[5、10、20 g/kg（按生藥量計），參考文獻[5]的半數致死量（LD50＝20 g/kg）；以蒸餾水為溶劑]，每組10只。取牛Ⅱ型膠原蛋白適量，溶解在0.05 mol/L醋酸溶液中，配制成質量濃度為2 mg/mL的膠原溶液，于4℃下靜置過夜；次日于冰浴條件下，滴加等體積弗氏完全佐劑，充分振蕩乳化后，得質量濃度為1 mg/mL的CIA乳劑。除空白組外，其余各組大鼠均于尾根部注射上述CIA乳劑0.1 mL以復制CIA模型，7 d后同法加強注射1次以延長作用時間[6]。造模后（即第1次注射后，下同）第7天，計算各組大鼠的關節炎指數（AI），若AI≥4則表示造模成功[7]。造模后第10天，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物，空白組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續2周。

2.3 一般情況觀察

造模后，觀察并記錄各組大鼠的毛發、進食飲水、活躍度、行為、大小便及體質量等情況。

2.4 AI的計算

于造模后第7、10、14、21、28天時按AI評分標準[7]評價各組大鼠的關節炎嚴重程度：關節無紅腫計0分，趾關節紅腫計1分，趾關節和足跖腫脹計2分，踝關節以下的足爪腫脹計3分，踝關節在內的全部足爪腫脹計4分。每個關節最高得分為4分，4個關節得分之和即為每只大鼠的AI。

2.5 足跖腫脹度的檢測

于造模前及造模后第7、10、14、21、28天時采用排水法以自制足容積測量儀檢測各組大鼠踝關節標記處以下部位的體積（V），考察其足跖腫脹度的變化情況[8]。

2.6 血清中IL-1β、TNF-α水平的檢測

于造模后第28天，斷頭處死各組大鼠，取血適量，以3 000×g離心15 min，留取上層血清，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.7 滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA表達的檢測

采用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達情況。取各組大鼠左側踝關節滑膜組織適量，使用Trizol試劑盒并參照其說明書方法提取組織中總RNA，使用逆轉錄試劑盒并參照其說明書方法獲取互補DNA（cDNA），使用PCR儀進行擴增（引物序列見表1），每個樣本設置3個復孔。反應體系（20 μL）：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR?Select Master Mix預混液10 μL，無核酶水8 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環；最后72℃再延伸10 min。所得產物經瓊脂糖凝膠電泳、染膠后，于紫外燈下拍照，使用凝膠影像分析儀進行光密度掃描，以目標基因與內參基因（β-actin）的光密度比值來表示目標基因mRNA的表達量。

2.8 踝關節組織病理學觀察

取各組大鼠右側踝關節組織適量，經4%多聚甲醛溶液中固定2 d、EDTA脫鈣液中脫鈣10 d后，用大量水清洗，經乙醇（體積分數分別為80%、95%、100%）梯度脫水、石蠟包埋、切片（厚度5 μm）后，行HE染色，以中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察大鼠踝關節組織病變情況。

表1 RT-PCR引物Tab 1 RT-PCR primer

2.9 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。采用Shapiro-Wilk法作正態性檢驗，Levene法作方差齊性檢驗。符合正態分布且方差齊性的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠的一般情況

八角楓水提液高劑量組有3只大鼠死亡，陽性組和八角楓水提液中劑量組各有1只大鼠造模失敗，其余大鼠均造模成功。造模后第7天，除空白組外的其余各組大鼠足部均出現綠豆大小的潰瘍，并逐漸結痂愈合；造模后第12天，除空白組外的其余各組大鼠足趾均皮膚發紅、發熱，輕度腫脹；造模后第14天，除空白組外的其余各組大鼠足底及踝關節均腫脹明顯，關節僵硬，活動量減少，飲食減少，毛發失去光澤，體質量增長較空白組緩慢，部分大鼠見稀便；造模后第21天，除空白組外的其余各組大鼠足底及踝關節腫脹程度均較模型組明顯減輕，活動及飲食量有所增加，體質量逐漸增加。

3.2 各組大鼠AI比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠AI均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。造模后第28天，陽性組和八角楓水提液各劑量組大鼠AI均較模型組顯著降低，且八角楓水提液高劑量組顯著低于陽性組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余時間點各給藥組大鼠AI與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠AI比較（x±s，分）Tab 2 Comparison of AI of rats in each group（x±s，score）

3.3 各組大鼠足跖腫脹度比較

造模后第7天，模型組和各給藥組大鼠足跖腫脹度均較空白組顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.01）；上述各組大鼠足跖腫脹度大多于造模后第14天達到峰值，隨后逐漸下降。造模后第21、28天，各給藥組大鼠足跖腫脹度均較模型組顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），但組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠足跖腫脹度比較（x±s，mL）Tab 3 Comparison of plantar swelling degree of rats in each group（x±s，mL）

3.4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平均顯著下降，且八角楓水提液高劑量組大鼠血清中IL-1β水平顯著低于陽性組，陽性組和八角楓水提液高劑量組大鼠血清中TNF-α水平均顯著低于其低、中劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其余各給藥組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較（x±s，ng/mL）Tab 4 Comparison of the serum levels of IL-1β and TNF-α of rats in each group（x±s，ng/mL）

3.5 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達量比較

與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠滑膜組織中OPG mRNA的表達量均顯著降低，RANKL、RANK mRNA的表達量均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織中OPG mRNA的表達量均顯著升高，RANKL、RANK mRNA的表達量均顯著降低，且八角楓水提液高劑量組大鼠滑膜組織中RANKL mRNA以及其中、高劑量組大鼠滑膜組織中RANK mRNA的表達量均顯著低于陽性組，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見圖1、表5。

圖1 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA表達的電泳圖Fig 1 Electrophorograms of mRNA expression of OPG，RANKL and RANK in synovium of rats in each group

表5 各組大鼠滑膜組織中OPG、RANKL、RANK mRNA的表達量比較（x±s）Tab 5 Comparison of mRNA expression amount of OPG，RANKL and RANK in synovium of rats in each group（x±s）

3.6 各組大鼠踝關節組織病變情況

空白組大鼠踝關節表面光滑，滑膜細胞無增生，周圍未見炎癥細胞浸潤。模型組大鼠關節間隙變窄，關節軟骨退變，局部可見骨質破壞，滑膜表面粗糙，滑膜細胞增生、層次紊亂，滑膜及周圍軟組織可見大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、巨噬細胞浸潤為主，可見豐富的血管翳形成，纖維母細胞和脂肪細胞增生活躍。與模型組比較，各給藥組大鼠關節軟骨退變、骨破壞及滑膜細胞增生明顯減輕，血管翳形成較少，炎癥細胞數量減少，僅見少量纖維母細胞及脂肪細胞增生，詳見圖2。

圖2 各組大鼠踝關節組織病理學觀察顯微圖（HE染色，×200）Fig 2 Micrographs of pathological observation in ankle joint of rats in each group（HE staining，×200）

4 討論

RA的病因十分復雜，發病機制尚不明確，其主要病理特征為關節滑膜慢性炎癥增生、關節軟骨及骨進行性退變和破壞，常表現出全身多關節腫痛、變形、功能障礙等臨床癥狀[9]。RA屬中醫“痹癥”范疇，又稱“鶴膝風”“歷節風”等，中醫認為其是由內、外因相合所致，其中稟賦不足、勞逸過度、飲食內傷等為內因，風、寒、濕、熱等邪氣侵襲為外因[10]?！端貑枴け哉摗分刑岬剑骸帮嬍匙员?、脾胃乃傷……淫氣憂思，痹聚在心”“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也”，闡釋了RA內外病因相合而為“痹”的觀點[11]。在以往的中醫臨床實踐中，許多中藥（如雷公藤、清風藤、馬錢子、豬儉草等）被用以治療RA，獲得了較好的臨床療效，其中雷公藤多苷、青藤堿等中藥單體抗RA的作用機制較為明確，已成為臨床公認的治療RA的常用藥物[12]，故本研究選用雷公藤多苷作為陽性對照藥物。

CIA誘導關節炎動物模型的病理特征為關節滑膜慢性炎癥增生、關節軟骨及骨侵蝕破壞，與RA發病過程類似[13]。相關文獻報道，初次免疫和加強免疫注射CIA乳劑后，模型小鼠會出現Th1/Th2亞群失衡，免疫系統中的T細胞和B細胞被活化，并分泌TNF-α、IL-1β、IL-17等炎癥細胞因子，誘導RANKL表達，抑制OPG合成，刺激滑膜纖維母細胞增生，促進破骨細胞成熟，引起滑膜增生、關節軟骨退變及骨破壞等病理學變化[14]。因此，CIA模型常作為RA病因病機研究的一種可靠的動物模型。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠AI和足跖腫脹度均顯著升高或增加，血清中IL-1β、TNF-α水平以及滑膜組織中RANKL、RANK mRNA的表達量均顯著升高，滑膜組織中OPG mRNA的表達量顯著降低；同時，其踝關節組織病理學觀察可見關節間隙變窄、關節軟骨退變，局部可見骨質破壞、滑膜表面粗糙、滑膜細胞增生，滑膜及周圍軟組織可見大量炎癥細胞浸潤及豐富血管翳形成，并伴有纖維母細胞和脂肪細胞增生活躍，提示造模成功。

八角楓系八角楓科八角楓屬植物，因其葉有八個角，故名為八角楓，是貴州地區苗族常用的抗RA藥材之一[15]。相關臨床研究顯示，以八角楓水煎液熏洗能夠緩解RA患者關節疼痛癥狀，并降低其血清中IL-6水平[2，16]。趙堂嬌等[17]應用以八角楓為主的中藥復方治療早期RA患者，臨床有效率可達91.67%。此外，張威[18]通過熱板法、扭體法、耳腫脹等實驗證實，八角楓水提液具有鎮痛、抗炎的作用。本研究結果顯示，不同劑量的八角楓水提液均可不同程度地降低大鼠AI，減輕其足跖腫脹度，并對其血清中IL-1β、TNF-α具有明顯的下調作用。TNF-α、IL-1β是公認的參與RA發病過程的重要致炎因子。其中，TNF-α參與了RA的多種致病機制，包括激活內皮細胞、誘導細胞因子釋放及破骨細胞活化等，導致炎癥反應的持續發生，并造成軟骨與骨的漸進性破壞；IL-1β能通過激活單核巨噬細胞以及T細胞、B細胞參與RA炎癥過程，同時可抑制關節軟骨及骨的修復[19-20]。兩者共同誘導RANKL表達，后者通過與破骨前體細胞表面的受體RANK結合來促進破骨細胞生成；而OPG是RANKL的誘騙受體，可抑制RANKL對破骨細胞生成的促進作用，RANKL/OPG表達水平的平衡是影響破骨細胞分化及其功能的重要調節因素[21-22]。因此，調節OPG/RANKL/RANK系統可能成為防治RA骨侵蝕的主要措施[23]。本研究結果顯示，與模型組比較，陽性組和八角楓水提液各劑量組大鼠滑膜組織中RANK、RANKL mRNA的表達量均顯著降低，OPG mRNA的表達量均顯著升高，且八角楓水提液高劑量組大鼠滑膜組織中RANKL mRNA以及八角楓水提液中、高劑量組大鼠滑膜組織中RANK mRNA的表達量均顯著低于陽性組。這提示八角楓水提液可通過下調RANK、RANKL mRNA及上調OPG mRNA的表達來發揮對OPG/RANKL/RANK系統的調節作用，且其高劑量組的作用強于陽性組。

另外，有臨床研究指出，長期過量服用八角楓可致人死亡[24]。實驗研究也證明，八角楓具有神經毒性，可引起實驗動物死亡[25]。在本研究實驗過程中，八角楓高劑量組（20 g/kg）中有3只大鼠死亡，其在灌胃后均出現呼吸減弱、抽搐、四肢癱軟等癥狀；而中劑量組（10 g/kg）和低劑量組（5 g/kg）均無大鼠出現上述癥狀或死亡。這提示與八角楓水提液高劑量組比較，其低、中劑量組的效果差異不大，而安全性更高。但該結論仍需進一步的毒理實驗來證實。

綜上所述，八角楓水提液能夠減輕CIA模型大鼠的炎癥反應、關節軟骨退變及骨破壞，其機制可能與下調血清IL-1β、TNF-α水平，調節OPG/RANKL/RANK系統平衡有關。但八角楓水提液對其他炎癥因子及信號通路的影響尚需進一步探討；此外，八角楓雖可治療RA，但仍有患者誤服致死的案例報道，故其安全用藥劑量有待進一步明確，其相關用藥知識也還需廣泛普及。