土家族藥三百棒的HPLC指紋圖譜研究Δ

文德鑒，丁慧云，斯琴，尹衡，涂星，2，袁麗君，袁林

（1.湖北民族學院醫學院，湖北 恩施 445000；2.風濕病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學院附屬民大醫院，湖北 恩施 445000）

三百棒為蕓香科植物飛龍掌血[Toddalia asiatica（Linn）Lam.]的干燥根或根皮，始載于《植物名實圖考》，又名見血飛、大救駕等，味微苦、辛，性溫，具有祛風止痛、散瘀止血、消腫解毒的功效，臨床多用于風濕痹痛、胃痛、跌打損傷、吐血、外傷出血、痛經、閉經、牙齦出血、口舌生瘡等癥的治療[1-2]，為土家族治療類風濕關節炎的習用藥物。研究顯示，三百棒主要含生物堿類、香豆素類、黃酮類和三萜類化合物，具有鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗心肌缺血、改善毛細血管通透性等作用[3-6]。三百棒多產于秦嶺南坡以南各地，最北見于陜西西鄉縣，在長江流域以湖北恩施、宜昌等地分布較多。由于土家族醫藥尚未形成體系，多以口耳相傳的形式傳授，導致三百棒名稱眾多、品種混亂，因此，有必要建立統一的質量標準。

中藥指紋圖譜是一種基于中藥化學成分信息的綜合的、可量化的鑒別手段，目前已成為國際公認最有效的控制天然藥物及相關制劑質量的方法。中藥指紋圖譜根據其測定時采用的分析手段不同可分為中藥化學指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜，前者又可分為中藥光譜指紋圖譜、中藥色譜指紋圖譜、中藥波譜指紋圖譜以及多種現代分析儀器聯用得到的多維多息指紋圖譜等[7-9]。而高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜屬于中藥色譜指紋圖譜，是一門涉及分析化學和計算機科學的跨學科技術，其以中藥的傳統形態學鑒定為依據，以重視藥味協同作用的中藥理論為指導，在確定中藥化學成分的基礎上，以中藥各有效成分的整體組成來評價中藥質量，目前在中藥材及中成藥的質量控制及真偽優劣鑒別上得到了廣泛的應用[10-13]。

本研究旨在通過HPLC指紋圖譜法，對湖北恩施9個不同產地的三百棒藥材進行質量分析，通過指紋圖譜相似度評價，綜合比較不同產地藥材之間的差異，為制定全面的三百棒藥材質量控制方法提供依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C型HPLC儀，含二極管陣列檢測器、四元梯度高壓輸液系統、自動進樣系統（日本Shimadzu公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；VX-200型旋渦混合器（美國Labnet公司）；Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-210型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；TESTO-511型便攜式絕壓表（德國Testo公司）。

1.2 試劑

巖白菜素對照品（批號：111532-201604，純度：94.1%）、毛兩面針素對照品（批號：111718-201402，純度：＞98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子超純水。

1.3 藥材

三百棒對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121410-200701）；9批三百棒藥材采集于恩施9個不同產地（見表1），經湖北民族學院醫學院朱敏英副教授鑒定為真品。

表1 三百棒藥材來源Tab 1 Sources of T.asiatica

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.75%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL[14]。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取巖白菜素對照品10 mg、毛兩面針素對照品5 mg，置于同一10 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，得巖白菜素、毛兩面針素質量濃度分別為1 000、500 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱取0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，稱定質量，50℃下超聲提取（功率：300 W，頻率：100 kHz）60 min；放冷至室溫，再次稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S2）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次。以巖白菜素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，14個共有峰相對保留時間的RSD均小于1%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以巖白菜素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，14個共有峰相對保留時間的RSD均小于3%（n＝7），相對峰面積的RSD均小于4%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以巖白菜素峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，14個共有峰相對保留時間的RSD均小于3%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于4%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評價、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》，以S1為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批藥材樣品中，有4批相似度均大于0.90，詳見表3。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 10批藥材樣品有14個共有峰，通過與對照品比對，指認3號峰對應成分為巖白菜素，12號峰對應成分為毛兩面針素。由于3號峰響應值更加穩定、分離更好，故設定為參照峰，以此峰計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表4、表5。

3 討論

圖1 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of samples

圖2 藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

表3 10批藥材樣品相似度評價結果Tab 3 Similarity evaluation of 10 batches of samples

筆者通過預試驗比較了分別以乙腈-0.05%磷酸溶液[15]、乙腈-0.1%磷酸溶液[16-17]、乙腈-0.75%冰醋酸溶液[18]作為流動相時對色譜圖的影響，發現以乙腈-0.75%冰醋酸溶液作為流動相進行梯度洗脫時獲得的色譜峰尖銳、基線漂移較小、分離度良好，且色譜峰信息豐富。故選擇乙腈-0.75%冰醋酸溶液作為流動相。筆者還比較了221、230、254、275、300、330、365 nm各檢測波長下獲得的色譜圖，發現在275 nm波長下獲得的色譜峰分離度良好、信息豐富，指紋圖譜的整體特征較穩定。故選擇275 nm作為檢測波長。

表4 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 4 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

表5 10批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 5 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

通過預試驗，筆者比較了分別以體積分數為100%、95%、80%、60%的乙醇和體積分數為100%、80%、60%的甲醇作溶劑提取藥材樣品粉末后所獲得的色譜圖，結果發現以80%甲醇作提取溶劑時獲得的色譜峰數目較多、峰面積較大；以乙醇提取時色譜峰數目雖然較多，但峰面積偏小；而當提取溶劑中水的比例過大時獲得的色譜峰較為雜亂、分離度較低。故選擇80%甲醇作提取溶劑。筆者還以對照藥材為研究對象，比較了超聲提取30、60、90 min時對色譜圖的影響，結果發現提取60 min和90 min時所測得的巖白菜素和毛兩面針素的峰面積無顯著性差異，且均顯著高于提取30 min時。出于節能考慮，選擇超聲提取時間為60 min。

本研究通過對恩施9個不同產地的三百棒藥材樣品的HPLC指紋圖譜研究，發現有14個共有峰；利川市建南鎮、利川市團堡鎮、恩施市鶴峰縣燕子鄉、恩施市巴東縣野三關鎮所產的藥材樣品與對照藥材比較相似度均大于0.90，其余產地藥材樣品相似度均小于0.90。結果表明，利川市建南鎮、利川市團堡鎮、恩施市鶴峰縣燕子鄉、恩施市巴東縣野三關鎮所產三百棒藥材質量相對較佳。而該4個產地均處于較高海拔地區，三百棒藥材質量是否與其產地的海拔高度有關還有待進一步研究。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜可為三百棒藥材質量控制提供依據。