三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響Δ

王振興，李水芹，趙梓亦，王飛

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脾胃病科，成都 610073）

腹膜轉(zhuǎn)移癌（Peritoneal carcinomatosis，PC）是惡性腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管、淋巴管轉(zhuǎn)移至腹膜腔后最常見的繼發(fā)性腹膜腫瘤，也是惡性腫瘤晚期最常見的并發(fā)癥[1]。其臨床治療難度大，患者中位生存期短、預(yù)后差[2-3]。目前臨床上采用全身化療、腹腔化療和姑息性手術(shù)治療PC的療效不佳，而細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合腹腔熱灌注化療（IHPC）是提高PC治療效果的主要措施[4]。IHPC是一種通過將恒溫（42～45℃）的化療藥液灌注入腹腔的治療方式，其在預(yù)防和治療腹膜種植轉(zhuǎn)移癌方面的作用已得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[5]。但是由于化療藥物價(jià)格昂貴且存在骨髓抑制等毒副作用，使其與IHPC的聯(lián)合應(yīng)用受到了很大限制[6]。

三棱、莪術(shù)是中藥配伍中常用的破血化瘀藥對[7]，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》載：“三棱氣味俱淡，微有辛意；莪術(shù)味微苦，氣微香，亦微有辛意；性皆微溫，為化瘀血之要藥。”本課題組在前期理論構(gòu)建中將PC納入中醫(yī)學(xué)“癌毒”的范疇，并指出癌毒阻絡(luò)、氣滯血瘀是其主要病機(jī)[8-9]；在前期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)三棱、莪術(shù)組分配伍聯(lián)合IHPC治療惡性腫瘤晚期癌性腹水具有顯著的療效，且比單純化療藥物治療對患者的毒副作用更小。據(jù)此，本課題組認(rèn)為將三棱、莪術(shù)組分聯(lián)合IHPC用于PC可能具有較好的臨床效果和較小的副作用。本課題組通過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對結(jié)腸癌細(xì)胞作用不同時(shí)間（0、6、12、24、48 h）的效果，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用以作用24 h時(shí)為最強(qiáng)。因此，本研究選擇易發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞為對象，考察三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療作用24 h時(shí)對腫瘤細(xì)胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響，為該療法臨床用于治療PC提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

3100型CO2培養(yǎng)箱（美國Fisher Scientific公司）；3-18K型冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；X71型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Ⅱ型多功能酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）；Navios流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；2C型精密電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

三棱免煎顆粒、莪術(shù)免煎顆粒[四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司；兩種免煎顆粒分別為采用三棱（批號：4301730）、莪術(shù)（批號：1362172）藥材提取物制備所得的同批次制劑]；Matrigel基質(zhì)膠、AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒（美國BD公司）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）、碘化丙啶（PI）、MTT試劑、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；胎牛血清、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 細(xì)胞

結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株購自American Type Culture Collection公司（編號：CLL-227），凍存于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞以37℃溫水復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng)。

2 方法

2.1 三棱、莪術(shù)提取物的細(xì)胞毒性考察

采用MTT法測定藥物的細(xì)胞毒性。取對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取三棱免煎顆粒，用PBS溶解制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液，按1.25、2.5、5、7.5、10 μg/mL加入各細(xì)胞孔；取莪術(shù)免煎顆粒，用PBS溶解制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液，按5、10、15、20、25 μg/mL加入各細(xì)胞孔；同時(shí)設(shè)置未經(jīng)過藥物處理的空白組。各組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)；棄去培養(yǎng)基，每孔加入PBS 100 μL、5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，充分震蕩至結(jié)晶物完全溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定吸光度（A），計(jì)算藥物對SW620細(xì)胞的抑制率[抑制率＝（1－A加藥組/A空白組）×100%]；同時(shí)，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，求算30%細(xì)胞生長抑制濃度（IC30）、50%細(xì)胞生長抑制濃度（IC50）。

2.2 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞死亡情況的影響考察

采用CFSE/PI雙熒光染色法考察細(xì)胞死亡情況。取對數(shù)生長期、融合度為50%～80%的SW620細(xì)胞，分為空白對照組（不作熱療處理，不加藥）、IC50三棱提取物組、IC50三棱提取物+熱療組、IC50莪術(shù)提取物組、IC50莪術(shù)提取物+熱療組。其中IC50三棱提取物+熱療組、IC50莪術(shù)提取物+熱療組細(xì)胞先在42℃條件下放置90 min進(jìn)行熱療處理。將經(jīng)過熱療處理或未經(jīng)熱療處理的各組細(xì)胞接種于12孔板（5×105個(gè)/孔），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。然后加入5 μmol/L CFSE染色液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)30 min；棄去培養(yǎng)基，按不同分組加入新鮮培養(yǎng)基或含有相應(yīng)藥物（三棱提取物為4.69 μg/mL，莪術(shù)提取物為16.81 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h；棄去培養(yǎng)基，加入10 μg/mL PI-PBS染色液2 mL，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)10 min；PBS沖洗細(xì)胞5 min×3次。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況（綠色熒光陽性/紅色熒光陰性者為活細(xì)胞，綠色熒光陽性/紅色熒光陽性者為死細(xì)胞）。

2.3 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞凋亡率的影響考察

為進(jìn)一步確認(rèn)三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞凋亡的影響，采用FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ試劑和PI試劑對SW620細(xì)胞進(jìn)行雙染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。按“2.2”項(xiàng)下方法分組并進(jìn)行熱療處理和給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后用0.25%胰蛋白酶消化處理后的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以PBS調(diào)整細(xì)胞終濃度至1×106個(gè)/mL。然后加入AnnexinⅤ-FITC 試劑20 μL和PI試劑5 μL進(jìn)行雙染色，輕柔混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，再加入PBS 300 μL，立即采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.4 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞遷移能力的影響考察

采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞遷移能力。用記號筆在6孔板的背面均勻劃橫線，各3條。取對數(shù)生長期SW620細(xì)胞接種于孔內(nèi)（1×106個(gè)/孔），在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，至次日細(xì)胞鋪滿板底。將細(xì)胞分為空白對照組（不作熱療處理，不加藥）、IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術(shù)提取物組、IC30莪術(shù)提取物+熱療組，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行熱療處理和給藥（三棱提取物為3.24 μg/mL，莪術(shù)提取物為11.27 μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用微量移液槍頭進(jìn)行劃痕，劃痕盡量與記號筆橫線垂直，不能傾斜；用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃痕后漂浮的細(xì)胞；然后在每孔中加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基2 mL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)獨(dú)立視野觀察劃痕愈合情況。

2.5 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞侵襲能力的影響考察

采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞侵襲能力。取－80℃下保存的Matrigel基質(zhì)膠于4℃過夜解凍。取培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠按5∶1體積比混勻后，分別取100 μL加入各個(gè)Transwell小室，于37℃下放置至凝固。取對數(shù)生長期SW620細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化液懸浮，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，然后取100 μL輕柔加入Transwell小室上層；在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL。按“2.4”項(xiàng)下方法分組并進(jìn)行熱療處理和給藥，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，以PBS清洗Transwell小室3次，以5%戊二醛溶液固定，4℃下放置10 min。加入0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫下染色30 min，以PBS沖洗Transwell小室，并用棉球擦去表面細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選擇5個(gè)獨(dú)立視野計(jì)算陽性染色細(xì)胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，用Fisher確切概率法進(jìn)行雙向檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三棱、莪術(shù)提取物的細(xì)胞毒性

結(jié)果顯示，隨著三棱、莪術(shù)提取物質(zhì)量濃度的增加，其對SW620細(xì)胞的抑制率也相應(yīng)升高。不同質(zhì)量濃度三棱、莪術(shù)提取物作用后的細(xì)胞增殖抑制曲線見圖1。根據(jù)該曲線求算得三棱提取物IC30為3.24 μg/mL，IC50為4.69 μg/mL；莪術(shù)提取物IC30為11.27 μg/mL，IC50為16.81 μg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度三棱、莪術(shù)提取物作用后的細(xì)胞增殖抑制曲線Fig 1 Cell proliferation inhibition curve after treated with different concentrations of S.stoloni extract or C.zedoaria extract

3.2 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞死亡情況的影響

結(jié)果顯示，與IC50三棱提取物組或IC50莪術(shù)提取物組比較，IC50三棱提取物+熱療組或IC50莪術(shù)提取物+熱療組的死亡細(xì)胞顯著增多，且在明場條件下可見其細(xì)胞皺縮更明顯，表明細(xì)胞存活狀態(tài)更差。各組細(xì)胞CFSE/PI雙熒光染色顯微圖見圖2。

圖2 各組細(xì)胞CFSE/PI雙熒光染色顯微圖（×40）Fig 2CFSE/PI double fluorescent staining microgram of cells in each group（×40）

3.3 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果顯示，IC50三棱提取物組細(xì)胞的凋亡早期率為0.3%、凋亡中晚期率為1.4%、壞死率為5.2%，IC50三棱提取物+熱療組細(xì)胞的凋亡早期率為0.9%、凋亡中晚期率為3.8%、壞死率為12.6%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IC50莪術(shù)提取物組細(xì)胞的凋亡早期率為7.8%、凋亡中晚期率為4.4%、壞死率為2.0%，IC50莪術(shù)提取物+熱療組細(xì)胞的凋亡早期率為1.3%、凋亡中晚期率為4.4%、壞死率為16.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療可明顯提高SW620細(xì)胞的凋亡率。各組細(xì)胞Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞圖見圖3。

3.4 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果顯示，與0 h比較，空白對照組細(xì)胞在24 h時(shí)的劃痕愈合間距明顯變窄，而IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術(shù)提取物組、IC30莪術(shù)提取物+熱療組細(xì)胞在24 h時(shí)的劃痕愈合間距未見明顯變窄。各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯微圖見圖4。

3.5 三棱、莪術(shù)提取物聯(lián)合熱療對細(xì)胞侵襲能力的影響

圖3 各組細(xì)胞AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞圖Fig 3 AnnexinⅤ/PI double staining flow cytometry of cells in each group

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，IC30三棱提取物組、IC30三棱提取物+熱療組、IC30莪術(shù)提取物組、IC30莪術(shù)提取物+熱療組在24 h時(shí)跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與IC30三棱提取物組或IC30莪術(shù)提取物組比較，IC30三棱提取物+熱療組或IC30莪術(shù)提取物+熱療組在24 h時(shí)跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減 少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明熱療加強(qiáng)了藥物對SW620細(xì)胞侵襲能力的抑制作用。其中，IC30三棱提取物+熱療組跨膜細(xì)胞數(shù)從IC30三棱提取物組的（152±23）個(gè)/視野減少至（31±6）個(gè)/視野，IC30莪術(shù)提取物+熱療組跨膜細(xì)胞數(shù)從IC30莪術(shù)提取物組的（189±41）個(gè)/視野減少至（67±15）個(gè)/視野。各組細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯微圖見圖5，跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖見圖6。

圖4 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯微圖（×40）Fig 4Microgram of cell scratch test in each group（×40）

圖5 各組細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯微圖（結(jié)晶紫染色，×100）Fig 5 Microgram of Transwell invasion test in each group（crystal violet staining，×100）

圖6 各組跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖Fig 6 Columnar graph of the number of transmembrane cells in each group

4 討論

IHPC是近年興起的一種腹腔惡性腫瘤治療手段，對各種腹腔惡性腫瘤的腹膜轉(zhuǎn)移均具有可靠的臨床療效[10]。IHPC通過持續(xù)高溫作用（42～43℃條件下作用90 min），能在不影響正常組織的情況下誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；同時(shí)高溫（＞41℃）可提高化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率來達(dá)到更佳的腫瘤抑制效果[11]。

三棱、莪術(shù)是具有破血祛瘀、行氣止痛功效的常用藥對[7]，具有悠久的中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史，是歷代醫(yī)家治療癥瘕積聚的常用藥物[12]。著名醫(yī)家王好古在《湯液本草》中曾言：“三棱，破血中之氣，肝經(jīng)血分藥也。三棱、莪術(shù)治積塊瘡硬者，乃堅(jiān)者削之也。”除了傳統(tǒng)中醫(yī)應(yīng)用，三棱、莪術(shù)近年來在臨床抗腫瘤治療方面的應(yīng)用也日趨廣泛，包括用于宮頸癌[13]、肺癌[14]、胃癌[15]、白血病[16]等的治療。三棱、莪術(shù)配伍后具有抗血栓、改善血液流變學(xué)、抗腫瘤、抗纖維化、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[17-20]。

本研究主要考察三棱、莪術(shù)提取物分別聯(lián)合熱療對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡及遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于三棱提取物組或莪術(shù)提取物組，三棱提取物+熱療組或莪術(shù)提取物+熱療組的細(xì)胞死亡數(shù)量增加、凋亡率顯著升高，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。由此可見，聯(lián)用熱療能夠明顯增強(qiáng)三棱或莪術(shù)提取物對SW620細(xì)胞的殺傷作用以及對其遷移和侵襲能力的抑制作用。本課題組下一步考慮將三棱、莪術(shù)的有效成分進(jìn)行配伍并與熱療聯(lián)用于SW620細(xì)胞，并選用更高熱療溫度以增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)進(jìn)一步探索該療法聯(lián)合中藥用于治療PC等腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制。