環孢素對系統性紅斑狼瘡模型小鼠的腎保護作用及其機制研究Δ

馬松鶴，夏令杰，陶熔，王靜，張洪峰

（1.河南省人民醫院疼痛科，鄭州 450003；2.大連醫科大學附屬第一人民醫院風濕免疫科，遼寧 大連 116044）

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種典型的自身免疫性疾病，其發病的核心機制是自身免疫功能紊亂；T細胞異常活化是免疫功能紊亂的樞紐，其經過一系列機體免疫呈遞過程后，最終活化B淋巴細胞，導致機體發生免疫反應產生多種自身抗體，累及多種組織器官[1]，尤其以腎臟受損最為常見。迄今，狼瘡腎炎（LN）仍為SLE主要致死原因之一。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導物（TWEAK）在人體胰腺、腸、心臟、大腦、卵巢及骨骼肌等組織中均有表達，另外在體外培養的人外周淋巴細胞、人巨噬細胞和人血管內皮細胞等中也檢測到相應表達，其生物活性與免疫調節作用密切相關[2-3]。已有研究發現，TWEAK表達水平與SLE疾病活動指數（SLEDAI）呈正相關[4]；SLE患者外周血T細胞中TWEAK的表達水平明顯高于類風濕關節炎（RA）患者和健康人群，而后兩者T細胞中TWEAK表達水平之間無明顯差異[5]。上述研究結果提示，TWEAK可作為判斷SLE病情活躍程度的特異性參考指標之一。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在淋巴T細胞和B細胞中均廣泛表達，并參與這兩種細胞的增殖和活化，同時在T細胞分化中也起著重要作用[6-9]。環孢素在臨床上可用于治療SLE，能夠有效抑制T細胞介導的細胞免疫反應，其機制主要是通過抑制白細胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）調控基因的轉錄，從而影響T細胞的增殖和活化[10]。但環孢素是否通過TWEAK-p38MAPK信號通路對SLE發揮治療作用，尚未見相關研究報道。因此，本課題組考察了環孢素對降植烷（Pristane）致SLE模型小鼠的免疫學指標、炎癥因子、腎功能指標及腎組織病變的改善作用，并通過研究環孢素對TWEAK-p38MAPK信號通路的影響，以探索環孢素治療SLE的作用機制，進而為闡明SLE的發病機制和拓展其診治新思路提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標儀（美國Thermo Electron公司）；CKX31型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；MIKRO 220R型冷凍離心機（德國Hettich公司）；RT-PCR擴增儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

環孢素（上海寰榮生物科技有限公司，批號：20171220，純度：98.9%）；醋酸潑尼松片（上海信誼藥廠有限公司，批號：180146，規格：5 mg）；降植烷、免疫球蛋白G（IgG）檢測試劑盒、免疫球蛋白M（IgM）檢測試劑盒（美國Sigma公司）；抗雙鏈DNA（ds-DNA）酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒[歐蒙（德國）醫學實驗診斷有限公司]；白細胞介素6（IL-6）、IFN-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒（美國eBioscience公司）；血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；考馬斯亮藍法檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；免疫組化試劑盒（含小鼠源IgG型一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體，北京百奧萊博科技有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ檢測試劑盒（日本Takara公司）；水為雙蒸去離子水。

1.3 引物

TWEAK上游引物5′-ATCGCAGCCCATTATGAAGT-3′、下游引物 5′-GAAGAGTCCGAAGTAGGTGAGG-3′，p38MAPK 上游引物 5′-TCGAGACCGTTTCAGTCCAT-3′、下游引物5′-CCACGGACAAATATCCACT-3′，GAPDH上游引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′、下游引物5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 動物

BALB/c小鼠60只，SPF級，雌性，體質量18～22 g，由湖北省醫學科學院動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0019。所有小鼠均在20～25℃室溫、12 h/12 h晝夜交替的條件下飼養，每天早晚各喂料1次，同時清洗飲水瓶并更換飲用水。

2 方法

2.1 SLE模型建立

取60只小鼠，隨機分為正常對照組（10只）和造模組（50只）。造模組小鼠一次性腹腔注射降植烷0.5 mL，正常對照組小鼠同法給予等體積生理鹽水。注射前及注射后2、3、4、5、6個月時，采用ELISA法檢測小鼠血清中抗ds-DNA抗體；注射前及注射后每月1次采用目測尿蛋白試紙檢測小鼠尿蛋白。結果，造模組小鼠注射降植烷2個月后，其抗ds-DNA抗體水平顯著高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01），且在6個月內該抗體水平逐漸升高；第6個月時，90%的造模組小鼠尿蛋白呈強陽性（++++），提示典型狼瘡病變形成。

2.2 分組、給藥及取樣

注射降植烷6個月后，取造模成功的小鼠40只，隨機分為模型組、陽性對照組（潑尼松，5 mg/kg）和環孢素高、低劑量組（30、10 mg/kg），每組10只。根據預實驗結果，陽性對照組和環孢素各劑量組小鼠灌胃相應劑量的藥物，每天1次，每周5次（固定在周一至周五早上9點給藥），連續18周；模型組和正常對照組小鼠同法給予等體積生理鹽水。實驗過程中，除模型組小鼠死亡4只、環孢素低劑量組小鼠死亡1只外，其余組小鼠均全部存活。記錄實驗過程中小鼠體質量變化情況。

所有存活小鼠均于末次灌胃1 h后按壓腹腔，每隔2 h按壓1次，采集24 h尿液備用。然后采用摘眼球取血法處死小鼠，將血液置于無抗凝劑的EP管中，靜置30 min后，2 000 r/min離心10 min，取上層血清，于－80℃保存備用。解剖全部小鼠，摘取小鼠腎臟，剪取約1/3于－80℃條件下保存備用，剩余部分固定于10%甲醛溶液中備用。

2.3 小鼠血清免疫學指標和炎癥因子水平檢測

采用ELISA法檢測小鼠血清中抗ds-DNA抗體、IgG、IgM、TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，按照相應試劑盒說明書進行操作。

2.4 小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平檢測

采用生物化學法檢測。取小鼠24 h尿液樣本，采用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白水平；取－80℃保存的血清樣本，解凍至室溫后，采用相應試劑盒檢測Cr和BUN水平，以評估小鼠腎功能。

2.5 小鼠腎組織病理變化觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察。取部分10%甲醛溶液中固定48 h的小鼠腎組織樣本，以水洗滌3 min×5次，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片；干燥后以二甲苯脫蠟，水化，HE染色；再以乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察腎組織損傷及炎癥細胞浸潤等情況。

2.6 小鼠腎組織中IgG免疫復合物沉積情況考察

采用免疫組化法考察。取10%甲醛溶液中固定48 h的部分小鼠腎組織樣本，按“2.5”項下“以水洗滌……浸蠟包埋，切片”操作，室溫下以1%過氧化氫溶液孵育10 min，以消除內源性過氧化氫酶活性；然后加入一抗（小鼠源IgG抗體，1∶100），4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗3 min×2次；羊血清（1∶10）封閉15 min，PBS清洗3 min×2次；加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（1∶100），室溫孵育30 min；DBA染液顯色，蘇木素染液復染，封片。每張切片在顯微鏡下取20個視野觀察IgG免疫復合物沉積情況（細胞核呈藍黑色，而沿腎小球毛細血管壁可見黃褐色沉積者為陽性），并采用Image Pro-Plus 6.0軟件分析陽性染色的平均光密度（IOD）值以表示其表達水平。

2.7 小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA表達水平檢測

采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測。取－80℃保存的腎組織樣本解凍至室溫（每組選取6只小鼠的腎臟，每個腎臟取5 mg組織樣本），制備勻漿。采用Trizol法提取RNA，逆轉錄合成cDNA。反應體系：5倍濃度的緩沖液2μL，逆轉錄酶1μL，RT-PCR混合液1μL，單鏈DNA（ss-DNA）2 μL，不含RNase的水加至20μL。反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；－4 ℃保存。

依據SYBR Premix Ex TaqTMⅡ檢測試劑盒說明書操作進行擴增。擴增體系：2倍濃度的PCR擴增液10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4 μL，cDNA 2μL，水7.2μL。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸25 s，共42個循環。

按照上述操作步驟，以GAPDH為參比，檢測各組小鼠p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平。

2.8 統計學方法

數據采用SPSS 22.0軟件進行統計處理。首先進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠體質量變化情況

造模過程中大多數小鼠的體質量有所下降；開始給藥后，隨著時間推移，陽性對照組和環孢素高、低劑量組小鼠體質量下降趨勢放緩或者有所增加，結果見表1。

表1 各組小鼠體質量變化情況（x±s，g）Tab 1 Body weight change of mice in each group（x±s，g）

3.2 各組小鼠血清免疫學指標水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中抗ds-DNA抗體、IgG、IgM水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明SLE模型成功建立。與模型組比較，陽性對照組小鼠抗ds-DNA抗體、IgM水平，環孢素高劑量組小鼠抗ds-DNA抗體、IgG、IgM水平，環孢素低劑量組小鼠抗ds-DNA抗體、IgG水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組小鼠血清免疫學指標水平檢測結果見表2。

表2 各組小鼠血清免疫學指標水平檢測結果（x±s）Tab 2 Result of serum immunological indicators levels of mice in each group（x±s）

3.3 各組小鼠血清炎癥因子水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和環孢素高劑量組的上述指標水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明環孢素能顯著抑制SLE模型小鼠炎癥因子的釋放。各組小鼠血清炎癥因子水平檢測結果見表3。

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平檢測結果（x±s，ng/L）Tab 3 Result of serum levels of inflammatory factor of mice in each group（x±s，ng/L）

3.4 各組小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和環孢素高劑量組小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平，環孢素低劑量組小鼠血清中BUN水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明環孢素能顯著改善SLE模型小鼠的腎功能。各組小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平檢測結果見表4。

表4 各組小鼠24 h尿蛋白和血清中Cr、BUN水平檢測結果（x±s）Tab 4 Results of 24 h urine protein and serum levels of Cr and BUN of mice in each group（x±s）

3.5 各組小鼠腎組織病理變化觀察結果

正常對照組小鼠腎組織形態結構正常，無炎癥細胞浸潤，未見明顯組織病理學變化；模型組小鼠腎組織結構不清晰，可見大量炎癥細胞浸潤，系膜基質增寬，且可見蛋白管型，部分管腔內皮細胞增生，毛細血管袢閉塞；陽性對照組和環孢素高、低劑量組小鼠腎組織炎癥細胞浸潤較少，系膜細胞增生、系膜基質增寬現象明顯減輕。各組小鼠腎組織病理學顯微圖見圖1。

3.6 各組小鼠腎組織中IgG免疫復合物沉積考察結果

與正常對照組比較，模型組小鼠腎小球內皮下和上皮可見大量黃褐色IgG免疫復合物沉積；IOD值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和環孢素高、低劑量組小鼠腎組織中黃褐色IgG免疫復合物沉積明顯減少；IOD值均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組小鼠腎組織中IgG免疫復合物表達水平檢測結果見表5。

圖1 各組小鼠腎組織病理學顯微圖（HE染色，×100）Fig 1 Pathological microscopy of renal tissue of mice in each group（HE staining，×100）

表5 各組小鼠腎組織中IgG免疫復合物表達水平檢測結果（x±s）Tab 5 Result of expression level of IgG immune complex in renal tissues of mice in each group（x±s）

3.7 各組小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平檢測結果

與正常對照組比較，模型組小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組的上述指標水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；環孢素高劑量組小鼠p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平，環孢素低劑量組小鼠TWEAK mRNA的表達水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明環孢素能抑制SLE模型小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達。各組小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平柱形圖見圖2。

圖2 各組小鼠腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平柱形圖Fig 2 Histogram of the expression level of p38MAPK and TWEAK mRNA in renal tissues of mice in each group

4 討論

本研究中，小鼠單次腹腔給予0.5 mL降植烷30 d后，逐漸產生自身免疫性抗體，且抗體水平漸漸升高；第6個月時90%的小鼠出現腎臟病變，主要表現為免疫復合物性腎小球腎炎，表明典型狼瘡病變形成，即SLE模型成功建立。有研究報道，降植烷能夠促進間皮細胞凋亡，并能激活Toll樣受體7（TLR7），使樹突狀細胞產生大量Ⅰ型干擾素（IFN-α）和白細胞介素12（IL-12），從而促使小鼠產生狼瘡樣病變，此病變是發生腎臟病變的重要過程[11]。雖然降植烷誘導SLE這一方法造模所需時間較長，但是能夠成功誘導90%以上的小鼠發生狼瘡樣病變，且此病變與人類SLE極其相似；加之該方法適用于多種非狼瘡易感性小鼠品系，因此現已廣泛用于SLE發病機制研究、新藥研發等領域[12-13]。

SLE作為一種常見的自身免疫性疾病，由于體內產生了大量致病性自身抗體和免疫復合物，可造成組織損傷，臨床上可表現出多個系統和臟器的損害，其中腎臟是最常受損的器官。據統計，幾乎所有的SLE患者的腎組織均有病理變化，且大部分都有臨床表現。p38MAPK是狼瘡腎炎發病的重要信號通路之一。在多種動物模型與細胞研究中均發現，p38MAPK參與調控IL-10及單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達[5-9]。且研究發現，p38MAPK信號通路可被TWEAK激活[5]。TWEAK是腫瘤壞死因子配體超家族的新成員，研究發現，TWEAK轉錄子具有誘導炎癥細胞因子產生、刺激細胞生長和血管生成的作用，在一定條件下還能誘導細胞凋亡；此外，許多TWEAK轉錄子還具有免疫調節的生物活性[14-15]。已有研究發現，SLE模型小鼠腎組織中TWEAK mRNA呈局部高表達，且其表達水平與腎病理損害程度呈正相關[16]。

本研究結果顯示，模型組小鼠血清免疫學指標（抗ds-DNA抗體、IgG、IgM）、炎癥因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ）、24 h尿蛋白及血清中Cr、BUN的水平均顯著升高；腎組織中IgG免疫復合物沉積明顯增加，病理變化明顯；腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平均顯著升高。環孢素給藥18周后，SLE模型小鼠血清免疫學指標、炎癥因子、24 h尿蛋白及血清中Cr、BUN的水平均顯著降低；腎組織中IgG免疫復合物沉積明顯減少，病理變化明顯減輕；腎組織中p38MAPK、TWEAK mRNA的表達水平均顯著降低。這表明環孢素對降植烷誘導的SLE模型小鼠的免疫學指標、炎癥因子、腎功能指標及腎組織病變等均有一定的改善作用。

綜上所述，環孢素對降植烷致SLE模型小鼠有一定的腎組織保護作用，對其腎損傷有一定改善作用，其機制可能與抑制TWEAK-p38MAPK信號通路有關。