犬發(fā)情期血清孕酮水平與最佳配種時間測定

張斌 歷可 周紅蕾 卓國榮 武彩紅

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 225300）

犬的發(fā)情是指犬在達到性成熟后在一些激素的作用下出現(xiàn)生理和行為的周期性變化。在繁殖學上講，犬是季節(jié)性單次發(fā)情動物或者雙次發(fā)情動物[1]正常情況，母犬一般一年發(fā)情兩次，母犬發(fā)情的標志是陰道流血，陰道流血正常情況下會持續(xù)21d左右[2]。每次發(fā)情間隔約6個月左右，單養(yǎng)犬多數(shù)在春秋兩季發(fā)情 （3～5月，9～11月）。根據(jù)犬的不同性生理變化，把犬性周期分為4個階段，即乏情期、發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情間期[3]。

法國斗牛犬發(fā)情期季節(jié)性較明顯，一般春秋兩季各一次，少數(shù)法國斗牛犬一年只發(fā)情一次，有的發(fā)情3次。法國斗牛犬發(fā)情期主要表示為陰門水腫，血性分泌物，接受爬跨交配。法國斗牛犬最初發(fā)情可出現(xiàn)在7～8月齡，發(fā)情期平均9～12d，發(fā)情后期配種率較高，即法國斗牛犬出現(xiàn)血性分泌物后第9～12天若交配極有可能懷孕。

通過孕酮的測定與陰道細胞學檢查確定母犬發(fā)情與否，以及所處的發(fā)情階段并幫助確定最佳配種時間。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取年齡在2～4歲，精神良好，食欲正常，在2017.10～2018.4就診于泰愛牧教學寵物醫(yī)院的法斗母犬共16例。就診主要檢測犬發(fā)情期變化及孕酮測定。

1.2 實驗儀器及材料

麥克奧迪顯微鏡、孕酮檢測儀。Diff-quik染液一套，購自上海納博科臨動物臨床檢驗實驗室；孕酮檢測試劑盒，購自北京德諾泰克科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 陰道涂片觀察

2.1.1 采樣

實驗犬保定好后，陰道口周圍清潔干凈，將浸泡過生理鹽水的滅菌棉簽插入陰道4～6cm，輕輕轉動棉簽2～3次，以保證棉簽能充分接觸陰道上皮細胞。

2.1.2 染色

將采集好的棉簽陰道內容物均勻涂抹在玻片上，自然晾干，diff-quik染色。首先，將要染色的涂片完全干燥之后放入固定液 （diff-quik A）中10～20s；然后，將涂片從固定液中取出無需沖洗可直接放入diff-quik B染液中染色5～10s，要使diff-quik B染液均勻染色玻片，無需沖洗；最后，將從玻片從diff-quik B液中取出直接放入diff-quik C染液中染色5～10s，要使diff-quik C染液均勻染色玻片。將玻片取出后用生理鹽水沖洗去剩下的染液，自然晾干即可，鏡檢[4]。

2.1.3 鏡檢觀察

每天記錄發(fā)情母犬血樣分泌物顏色及分泌量，陰唇腫脹程度等。顯微鏡下觀察陰道涂片，主要觀察角質化上皮細胞的形態(tài)、邊緣、核膜，并對角質化上皮細胞比例進行統(tǒng)計。

2.2 血清孕酮測定

實驗犬保定，剃毛，消毒，前肢頭靜脈采血2ml，12000r/min離心3min分離，離心提取血清，用移液器抽取50μl血清加入稀釋液混合均勻后抽取100μl混合液，滴到試劑卡加樣孔上，待混合液從圓孔流到前端空格處，將試劑卡插入熒光儀卡槽內，點擊熒光儀屏幕上的 “開始測試”，10min讀取檢測結果。

3 結果與分析

3.1 陰道涂片細胞形態(tài)變化

發(fā)情前期 （持續(xù)6～11d）：有大量紅細胞和副基底上皮細胞出現(xiàn)，發(fā)情期繼續(xù)發(fā)展會出現(xiàn)紅細胞數(shù)量逐漸減少，但上皮細胞會出現(xiàn)角化跡象并且會逐漸增加。到發(fā)情前期的晚期時，幾乎所有的上皮細胞都會表現(xiàn)為伴有核固縮的中間細胞，也有時會出現(xiàn)少量的嗜中性粒細胞[8](見圖1)。

發(fā)情期 （持續(xù)5～9d）：所有的鱗狀上皮細胞為角化狀態(tài)，一般呈多邊形，不規(guī)則，角化程度不一，著色情況也不一致。通常無核或有一個 “影核”或者固縮的小核殘體；隨著發(fā)情的持續(xù)，至發(fā)情配種后時可達到75%以上，發(fā)情期結束后會逐漸下降[7]。無中性粒細胞，可能出現(xiàn)少量的紅細胞；發(fā)情末期時紅細胞會持續(xù)下降，同時嗜中性粒細胞會急劇上升 （見圖2）。

發(fā)情間期 （56～60d）：角化的鱗狀上皮細胞數(shù)量急劇下降，中間細胞和副基底細胞再次出現(xiàn)，嗜中性粒細胞數(shù)量的增加，有時可見一些紅細胞 （見圖3）。

3.2 血清孕酮的結果

3.2.1 血清孕酮水平

本次試驗對泰愛牧寵物醫(yī)院臨床孕酮檢測的16例法斗母犬進行分析，主述所有犬均處于發(fā)情期。按照犬場慣例，首次陰道排血記錄為第一天發(fā)情。所有犬孕酮測定均在發(fā)情第12～14天內檢測[5]。所有犬均采用人工授精方式配種，配種時間均在孕酮測定后48h內完成。一個月后回訪，編號3、5、8、12犬配種不成功，其他犬只都配種成功。成功率75%。配種成功的犬在發(fā)情12～14d檢測孕酮值均處25～45ng/ml，配種不成功的犬孕酮均超過45ng/ml。由圖表明孕酮測定值在20～40ng/ml時是最佳配種期 （見附表、見圖 4）。

圖1 發(fā)情前期陰道涂片

圖2 發(fā)情期陰道涂片

圖3 發(fā)情間期陰道涂片

圖4 犬發(fā)情期孕酮測定值分布圖

4 討論與分析

4.1 陰道鱗狀上皮細胞角化程度可確定配種時間

資料表明，鱗狀上皮細胞的角化程度和體內雌二醇和孕酮濃度變化息息相關，雌二醇和孕酮水平的變化決定了鱗狀上皮細胞的角化程度[10]。犬在發(fā)情開始后的9～12d雌二醇達到峰值，之后逐漸下降，孕酮濃度在發(fā)情前期開始后的9～12d也開始升高，在此期間，通過對陰道涂片的連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)情母犬隨著時間推移，角化細胞數(shù)量在逐漸增多，發(fā)情后第10～ll天可達80%～90%，可維持2～3d，隨后開始逐漸減少消失[6]。因此，可以通過觀察陰道上皮細胞的角化程度來大致確定配種時間。

4.2 孕酮測定確定配種時間

孕酮由黃體分泌，屬于甾體激素，在排卵、妊娠、分娩、乳腺發(fā)育等各方面都發(fā)揮著至關重要的作用[9]。孕酮在犬發(fā)情前期濃度較低，且上升緩慢，一般維持在1～5ng/ml。孕酮達到5ng/ml時犬一般開始排卵。在發(fā)情期，隨著雌二醇濃度下降，孕酮濃度會逐漸上升，孕酮濃度達到25～45ng/ml時達到最佳配種時間，孕酮值上升至20ng/ml時可進行第一次配種，48h后可進行第二次配種；孕酮濃度達到25～40ng/ml時建議2～3h后配種，48h后可進行第二次配種，以提高配種成功率。孕酮測定值達到45ng/ml時，說明犬已進入發(fā)情后期，不建議配種。

鑒定母犬發(fā)情的方法常用陰道涂片和孕酮測定法，每一種方法均有其優(yōu)缺點[11]。要準確把握犬的配種時間，建議同時使用兩種方法一起判斷。同時，犬的發(fā)情會受到年齡、營養(yǎng)狀況、生活環(huán)境、光照等多種的條件會影響犬的發(fā)情，在生產(chǎn)實踐中，應根據(jù)犬實際情況綜合推斷犬最佳配種時間[12]。

附表 犬編號與孕酮結果