尿液標志物診斷膀胱癌的研究進展△

朱金鋒 綜述，王小林審校

南通市腫瘤醫院泌尿外科，江蘇 南通 2263610

膀胱癌占中國泌尿生殖系統腫瘤發病率的第1位，據2015年中國癌癥年報統計，2015年中國約有8.05萬新發病例，約3.29萬患者死于膀胱癌[1]。膀胱尿路上皮細胞癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）是最常見的組織學類型，占膀胱癌的90%以上[2]。研究顯示，近75%的新診斷的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[2]，根據臨床治療指南，該類膀胱癌通常采用經尿道膀胱腫瘤電切術伴或不伴膀胱內的灌注治療[3]；其余25%的膀胱癌為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），其標準治療方法為根治性膀胱切除術和雙側淋巴結清掃術伴或不伴圍手術期化療[4]。研究表明，50%的NMIBC患者5年內復發，多達30%的患者盡管接受了有效的治療，但最終還是進展為MIBC，導致預后較差[5]。因此，膀胱癌患者需終生嚴密隨訪。

膀胱鏡檢查及尿液脫落細胞學檢查仍是膀胱癌診斷的金標準。膀胱鏡檢查膀胱癌的靈敏度為90%，但它是一種侵入性檢查，且費用昂貴，患者對隨訪的依從性較差[6]。尿液脫落細胞學檢查是一種特異度高（99%）的檢測方法，但靈敏度較低（34%），特別是診斷低級別腫瘤時靈敏度更低[7-8]，而且受到檢查者主觀因素的影響。因此，為了提高膀胱癌患者的生活質量和管理水平，許多研究者都在尋找一種非侵入性、高靈敏度和特異度的膀胱腫瘤標志物。尿液是與膀胱癌直接接觸的體液，而且可以被大量地非侵入性地收集，尿液標志物檢測膀胱腫瘤是未來的發展趨勢。迄今為止，美國食品藥品監督管理局（FDA）已經批準將BTA-stat、BTAtrak、NMP22 BladderChek Test、NMP22BC test kit、ImmunoCyt、UroVysion、CxBladder、FDP 等用于臨床。這些檢測方法與尿液脫落細胞學檢查相比，雖然具有較高的靈敏度，但因特異度較差而未能在臨床上普及。因此，迫切需要一種特異性標志物用于膀胱癌的早期診斷及術后復發監測。

1 美國FDA已經批準用于臨床的尿液膀胱腫瘤標志物

1.1 核基質蛋白22

核基質蛋白（nuclear matrix protein，NMP）是一種蛋白質家族，在細胞核的結構框架中發揮重要作用，并與DNA復制、RNA合成及激素合成有關。核基質蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）是構成細胞核內部框架的裝配蛋白，使細胞核內的染色質在有絲分裂期間有規律地分布到子細胞中[9]。有研究表明，膀胱癌患者尿液中的NMP22濃度是健康者的5倍[10]。目前，研究者已經研究出了2種檢測尿液中NMP22水平的方法，一種是定量的酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），另 一 種 是 定 性 的NMP22 BladderChek試驗，后者被應用于床旁檢測（point of care，POC）。在NMP22的檢測試劑盒上滴幾滴尿液，30 min內便可獲得結果。這兩項測試均已獲美國FDA批準用于膀胱癌的監測。一項納入41項研究、涉及13 885例患者的Meta分析結果顯示，NMP22檢測膀胱癌的靈敏度為68%，高于尿液脫落細胞學檢查的44%，但NMP22檢測的特異度低于尿液脫落細胞學檢查（79%vs95%）[11]。由于NMP22是一種普遍存在的核蛋白，因此炎性感染、血尿、尿石癥或手術創傷都會增加尿中NMP22的釋放[12-13]。研究表明，NMP22結合膀胱鏡檢查可使膀胱癌的復發檢出率顯著提高，高達99%，而單獨使用膀胱鏡檢查的檢出率僅為91%[14]。另有研究表明，腫瘤的級別越高，階段越晚，NMP22靈敏度越高[15]。因此，NMP22尚不能取代膀胱鏡檢查在臨床中的作用，但通過NMP22檢測可以降低膀胱癌術后患者膀胱鏡檢查的頻率。此外，NMP22還適用于高級別膀胱癌的早期檢測。

1.2 膀胱腫瘤抗原

膀胱腫瘤抗原（bladder cancer antigen，BTA）是一種膀胱癌細胞產生的人補體因子H相關蛋白。BTA通過打斷補體級聯反應，使腫瘤細胞具有選擇性生長優勢，從而逃避宿主免疫系統[16]。尿液BTA常用的檢測方法有兩種：BTAtrak是一種定量的ELISA檢測方法，BTAstat是一種快速特異性試驗。研究表明，BTAtrak檢測膀胱癌的靈敏度和特異度分別為66%和65%，而BTAstat的靈敏度為70%，特異度為75%[17]。兩種檢測方法的靈敏度均隨腫瘤級別的增加而提高，但特異度仍低于尿液脫落細胞學檢查[18]。大部分的假陽性結果是由血尿、良性前列腺增生、感染、炎性反應、結石、卡介苗灌注史和腸道介入史導致的。因為這些良性疾病的干擾，導致BTA的特異度僅為56%[19]。目前BTA的價值有限，很少用于臨床決策。

1.3 免疫細胞試驗

免疫細胞試驗（ImmunoCyt test）是尿液脫落細胞學檢查和免疫熒光法的結合，使用3種熒光單克隆抗體檢測3種特異性膀胱腫瘤抗原：M344是一種高分子量的癌胚抗原，LDQ10和19A11是與膀胱腫瘤細胞相關的黏蛋白。該測試需要經驗豐富的細胞病理醫師及大量的脫落細胞才能獲得準確的結果。當觀察到1個紅色或綠色熒光時即為陽性細胞，但制造商建議所有陽性細胞應與形態相關[20]。該測試被美國FDA批準用于對具有膀胱癌病史的患者進行監測。在一項包含10項研究、4199例膀胱癌患者的系統回顧性研究中，ImmunoCyt檢測的總體靈敏度為84%，特異度為75%；在低級別的腫瘤中，ImmunoCyt檢測的靈敏度高于尿液脫落細胞學檢查[11]。在一項包含2217例膀胱癌患者的研究中，Immuno-Cyt檢測與尿液脫落細胞學檢查聯合時，總體靈敏度為73%，1級腫瘤為59%，2級腫瘤為77%，3級腫瘤為90%，但聯合檢測的特異度仍低于尿液脫落細胞學檢查（72%vs98%）[21]。研究表明，作為一種基于細胞的分析，與其他試驗相比，ImmunoCyt檢測受血尿和炎性反應的影響較小[22]。在一項涉及1182例膀胱癌患者的多中心前瞻性研究中，這些患者既沒有膀胱癌病史，也沒有無痛性血尿史，ImmunoCyt檢測能夠很好地預測膀胱癌的發生[23]。盡管如此，ImmunoCyt檢測受樣品穩定性及制備過程的影響，也受檢測者的主觀性影響，因此在臨床上較少使用。

1.4 熒光原位雜交技術

UroVysion是一種多靶點熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術，能夠從尿液脫落細胞中鑒定出最常見的尿路上皮癌細胞3、7和17號染色體的非整倍性以及p16抑癌基因9p21位點的缺失。迄今為止，還沒有UroVysion試驗陽性的統一標準，但是當觀察到至少25個異常細胞中≥4個細胞出現以上染色體改變或≥12個細胞出現9p21位點的純合子缺失時，通常被認為陽性[24]。該測試已被美國FDA批準用于對有膀胱癌病史的患者進行監測。在一項包含2477項FISH檢測的Meta分析中，UroVysion檢測膀胱癌的靈敏度為72%，優于尿液脫落細胞學檢查，但特異度較低，僅有83%[25]。UroVysion試驗在膀胱癌的早期診斷和預后評估中具有無創、靈敏度和特異度高等優點，是早期診斷及監測UCB較為理想的手段，UroVysion試驗使用的探針可在同一細胞內同時顯示4種遺傳學改變，在中國人群中診斷膀胱癌同樣具有較高的應用價值。隨著此項技術的成熟及試劑成本的降低，相信UroVysion FISH在膀胱癌的早期診斷中將有著廣泛的應用前景。

1.5 CxBladder

CxBladder是 基 于4種mRNA（IGFBP5、HOXA13、MDK、CDK1）在膀胱癌患者尿液中顯著增加的檢測，另一種mRNA（CXCR2）與炎性反應相關，用來減少假陽性率，試驗中通過實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time-polymerase chain reaction，RT-PCR）評估這些mRNA的表達。在一項包括485例存在血尿而沒有膀胱癌病史的患者的前瞻性研究中，CxBladder檢測膀胱癌的靈敏度為82%，特異度為85%[26]。

1.6 纖維蛋白（原）降解產物

纖維蛋白（原）降解產物（fibrin/fibrinogen degradation product，FDP）是在纖溶亢進時產生的纖溶酶的作用下，纖維蛋白或纖維蛋白原被分解后產生的降解產物的總稱。腫瘤細胞表面存在多種纖溶酶原激活物受體，該受體與腫瘤細胞產生的纖溶酶原激活物結合，進而激活纖溶酶。激活的纖溶酶分解纖維蛋白原和纖維蛋白，從而產生大量的FDP經尿液排出。有研究發現，FDP診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為64%和77%[27]。中國的一項研究運用乳膠凝集半定量測定法檢測尿液中FDP的水平，結果發現，膀胱癌患者中尿液FDP﹥4 μg/ml占88%，而正常對照組尿中FDP的含量極低，絕大多數﹤2 μg/ml[28]。

2 美國FDA未經批準的膀胱腫瘤標志物

2.1 膀胱癌特異性核基質蛋白

膀胱癌特異性核基質蛋白（bladder cancer spe-cific nuclear matrix protein，BLCA）于1996年由Van Le等[29]首先發現并報道，他們通過蛋白組學的方法提取膀胱癌組織，分別命名為BLCA1-4和BLCA-6。BLCA-4在泌尿系統良性疾病及泌尿系統其他惡性腫瘤中均未被檢測出。Konety等[30]采用更為先進的雙抗免疫夾心法在大樣本中進行檢測，獲得了類似的結果，膀胱癌檢測的靈敏度達89%，特異度達95%。BLCA-4除在膀胱癌組織中表達外，在鄰近腫瘤的正常黏膜中也有表達。Myers-Irvin等[31]檢測了BLCA-1在膀胱組織及尿液中的表達水平，結果發現BLCA-1在膀胱癌患者的尿液中特異性表達，而在前列腺癌及腎細胞癌患者的尿液中無表達。此外，與BLCA-4在膀胱癌旁正常黏膜中也有表達不同，BLCA-1僅在膀胱腫瘤細胞中表達，提示兩者在膀胱癌發生過程中的作用不同。對中國人群而言，尿液BLCA-1和BLCA-4均為具有高特異度及靈敏度的膀胱癌早期診斷標志物。當cut-off值設定為0.0009 OD/μg時，BLCA-1檢測膀胱癌可獲得良好的效能，靈敏度為92.7%，特異度為 92.9%；cut-off值取 0.00017 OD/μg時，BLCA-4檢測膀胱癌可獲得最好的效能，靈敏度為97.4%，特異度為100%。尿液BLCA-1檢測與膀胱癌的分期、分級無明顯相關性，而尿液中BLCA-4的檢測對MIBC更有價值[32]。

2.2 存活素mRNA

存活素mRNA是最新發現的一類凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis family of proteins，IAP）成員，可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。但與其他家族成員不同的是，存活素mRNA只包含一部分保守的輪狀病毒IAP重復結構，而無羧基末端鋅指結構。有研究顯示，存活素mRNA診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別高達85.71%和90.91%。同時，存活素mRNA的表達與腫瘤的臨床分期密切相關，對T1S～T1亞組患者的靈敏度僅為79.55%，明顯低于T2～T4亞組患者的100%，差異有統計學意義（P﹤0.05）[33]。說明存活素mRNA的表達水平隨著膀胱癌分化程度的降低而逐漸升高，影響腫瘤的惡性程度和發展趨勢。

2.3 細胞凋亡標志物

2.3.1 可溶性Fas可溶性Fas（soluble Fas，sFas）是膀胱癌細胞產生和釋放的抗凋亡蛋白，可以干擾Fas配體間的相互作用，抑制腫瘤細胞凋亡。sFas在尿液中的水平已被證明是膀胱癌復發的獨立預測因子[34]。在一項納入191例膀胱癌患者的研究中，sFas診斷的靈敏度和特異度分別為88%和89%[35]。與NMP22相比，sFas似乎可以更好地預測膀胱癌及其侵襲能力。

2.3.2 叢生蛋白 叢生蛋白（clusterin）是一種多功能的分泌糖蛋白，在腫瘤的發生和發展過程中具有重要作用。研究表明，clusterin表達水平在膀胱癌患者的尿液中明顯升高[36]。另有研究報道，clusterin診斷膀胱癌的靈敏度為70%～87%，特異度為83%～97%[37]。

2.4 血管生成標志物

2.4.1 血管內皮生長因子 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是膀胱癌細胞血管生成的重要介質，在促進腫瘤細胞浸潤、轉移的過程中具有重要作用。VEGF水平與膀胱癌存在相關性，且隨著腫瘤級別的增加而增加。VEGF可能通過旁分泌作用于內皮細胞，刺激內皮細胞增殖，誘導腫瘤血管生成，增加血管通透性，促進腫瘤細胞侵襲轉移。因此，隨著膀胱癌病理分級與臨床分期的增加，VEGF表達水平升高，血管生成能力增強。有研究顯示，VEGF診斷膀胱癌的靈敏度為68%～83%，特異度為62%～93%[38]。

2.4.2 白細胞介素 白細胞介素（interleukin，IL）是由白細胞分泌的小信號蛋白，參與免疫系統的炎性反應過程。膀胱癌患者尿液中IL-8的水平明顯升高，在普通檢測環境中，IL-8檢測表現出較高的準確性，在灌注卡介苗后的監測環境中，經歷疾病復發的患者尿液中IL-8的水平更高[39]。IL-6/IL-10已被證明可以預測卡介苗應用后的復發和中度風險患者的復發，靈敏度為83%，特異度為76%[40]。雖然血管生成和炎性反應是腫瘤的明確標志，但它們是非特異性的，因此對膀胱癌的診斷或監測意義不大。

2.5 增殖與侵襲相關標志物

2.5.1 端粒酶 端粒酶是真核細胞染色體末端具有穩定DNA序列和防止染色體復制時縮短的功能性異質化結構，對于防止染色體畸變和維持下游基因遺傳信息的穩定具有重要意義。端粒酶在絕大多數正常體細胞中呈失活狀態，但在膀胱癌發生過程中可被重新激活。目前主要通過端粒重復序列擴增技術和PCR技術檢測端粒酶[41]。由于端粒酶活性缺乏特異性，導致其假陽性率較高。

2.5.2 透明質酸 透明質酸是組成細胞外基質的一種黏多糖，與細胞黏附和增殖有關。透明質酸可被透明質酸酶降解成促進血管生成的小片段。兩種成分在膀胱癌患者的尿液中都有增加。兩者結合后，測試性能優于單獨測試，靈敏度為92%，特異度為85%[42]。透明質酸/透明質酸酶的水平與腫瘤級別相關[43]，但還需要進一步的研究來評估該生物標志物的臨床效應。

2.5.3 纖維粘連蛋白 纖維粘連蛋白是一種結構糖蛋白，廣泛存在于細胞、血漿和細胞外基質中，與細胞的遷移和黏附有關。當出現腫瘤時，細胞外基質的組成部分被蛋白酶降解，為腫瘤的轉移或侵襲創造條件。在一項納入5項研究、649例患者和291個對照組的Meta分析中，纖維粘連蛋白檢測膀胱腫瘤的靈敏度為81%，特異度為80%[43]。

2.6 基因相關生物標志物

2.6.1 成纖維生長因子受體 3成纖維生長因子受體 3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）突變可以出現在50%以上的膀胱癌患者中，FGFR3突變是膀胱癌復發的獨立預測因子[44]。在低級別膀胱腫瘤中，FGFR3檢測的靈敏度為58%，高于尿液脫落細胞學檢查[45]。FGFR3檢測具有多種用途，包括腫瘤的檢測、藥物作用的靶點檢測和監測治療反應等。

2.6.2 DNA甲基化 在腫瘤形成的過程中常常伴有DNA異常甲基化。很多基因的CpG島異常甲基化伴隨著膀胱癌的發生發展，在膀胱癌組織標本和患者尿液標本中能檢測出多種基因的異常甲基化。Reinert等[46]應用RT-PCR技術對184例非浸潤性膀胱癌患者的390份尿沉渣細胞的EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM和ZNF154基因的甲基化水平進行檢測，靈敏度為82%～89%，特異度為94%～100%。目前甲基化機制在表觀遺傳學中的研究較為深入，很多抑癌基因的異常甲基化參與了腫瘤的發生和發展。

2.6.3 微RNA 微RNA（microRNA，miRNA）是一種小型的非編碼RNA，通過結合mRNA來調節轉錄后基因的表達。miRNA表達的改變可誘導腫瘤發生，并可通過RT-PCR測量，一些miRNA沉默的表觀遺傳改變已經顯示參與膀胱癌的發展。研究表明，miRNA-137、miRNA-124-2、miRNA-124-3、miRNA-9-3檢測膀胱癌的靈敏度為81%，特異度為89%[47]。

3 小結

膀胱鏡檢查和活體組織檢查是臨床推薦的診斷膀胱癌最可靠的方法，但具有侵入性且費用昂貴。因此，作為膀胱鏡檢查及活體組織檢查的補充，通過尿液腫瘤標志物輔助檢查可以提高膀胱癌的檢出率，為膀胱癌的診斷提供安全、簡單、無創的檢查手段。