Western blot在大鼠心肌缺血炎性因子研究中的應用*

余幫興 梁文斌 王 文

(1. 首都醫科大學宣武醫院實驗動物室，北京 100053)(2. 武漢市武東醫院、武漢市第二精神病醫院外科， 武漢 430084)

Western blot技術廣泛應用于檢測蛋白水平的表達[1-3]，該實驗技術步驟繁瑣。急性心肌梗死是一個嚴重威脅人類的高死亡率的疾病。炎癥在急性心肌梗死損傷與修復中有著重要的作用[4]。本文探討Western blot在大鼠心肌缺血炎性因子研究中的應用：

1 材料與方法

1.1 材料

研究用的抗體及化學試劑等：IL-6(abcam,ab9324)，TNF-α(abcam,ab11564)，IL-1β(abcam, ab9722)，GAPDH(CST,#5174)，NF-κB p65(abcam,ab19870)，NF-κB p65(CST8242)，二抗(中杉金橋ZB2301、ZB2305, ZSGB-BIO, 中國)，RIPA裂解液(強)(碧云天公司)等。

1.2 實驗儀器

小動物呼吸機；多導生理信號記錄儀； Bio-Rad電泳儀；化學發光凝膠成像系統等。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠,體質量250～280 g，北京維通利華公司購入，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.4 方法

1.4.1心肌缺血造模[5]:6-0帶線縫合針結扎大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)，造模成功后3 d摘取大鼠心臟，轉存于-80 ℃冰箱。

1.4.2樣品制備:用眼科剪快速剪碎心臟左心室組織，按1∶6的比例加裂解液RIPA，再加1%PMSF(1 mL RIPA加10 μL PMSF)，靜置半小時以上，先機械勻漿至沒有明顯的大顆粒，再超聲粉碎至沒有沉淀，所有步驟均需在冰上操作，以防止蛋白質變性。12 000 r/min 30 min離心取上清液轉移至新的EP管中。離心機應提前預冷至4 ℃。

1.4.3定蛋白(BCA法): BCA定量法(參考普利萊公司BCA試劑盒說明書)，所有步驟均需在冰上操作。定蛋白過程如下：8個EP管分別標記1 600、800、400、200、100、50、25、0(盡量用小的EP管，這樣誤差小，標準曲線才可能更準確)，第一個EP管90 μL ddH2O，余下每個EP管均80 μL，然后第一個1 600 EP管加60 μL BSA標準品，以渦旋器上最大渦旋速度渦旋1 600 EP管并用移液器反復吹打，以保證蛋白在ddH2O中充分混勻，然后吸1 600 EP管中物80 μL入800EP管中，渦旋器上最大渦旋速度渦旋EP管并移液器反復吹打；吸800EP管中物80 μL入400EP管中，依此類推至25EP管，最后一個EP管僅含ddH2O。倍比稀釋每步均需充分渦旋并用移液器反復吹打。樣本按表1稀釋。

表1 標準品BSA及樣品稀釋方法

注:之具體含義參見文中詳細描述 Note:described in detail in this paper

工作液(WR)配制： 1 mL BCA Reagent+20 μL Cu Reagent為WR(多配點，保證夠用)，呈綠色。

96孔板中每孔加25 μL稀釋后的BSA及樣本溶液，然后每孔按200 μL加工作液(WR)。96孔板搖床上37 ℃ 30 min。用酶標儀(波長562 nm)測A值(2個復孔)。

Microsoft Excel 軟件上操作：散點圖 → 標準曲線 →A平均值 → 蛋白濃度→ 樣品體積μL(以最低蛋白濃度為準×100/蛋白濃度)→ 加裂解液體積μL(100-樣品體積)。 加5×loading buffer 25 μL(即變成1×LB)，95 ℃ 10 min變性。舉例如表2、圖1、表3。

圖1 標準品BSA標準曲線

表2 標準品BSA倍比稀釋后A值結果

表3 100 μL變性前樣品(原樣品體積及應加入裂解液體積)

注：75.2=33030/439.1,81.3=33030/406.1333

1.4.4灌注凝膠和電泳

第一步：清洗玻璃板

第二步：配膠

①對齊玻璃板,垂直卡緊在Bio-Rad綠色架子上；

②根據目的蛋白的分子量配不同濃度的分離膠，在分離膠溶液中加入過硫酸銨(AP)、TEMED，立即快速搖動混合并迅速往兩玻璃板的間隙中灌注溶液,至約平綠色架子橫桿下緣處(梳子的齒長再加0.5 cm)。隨后在分離膠上小心加一層雙蒸水[6]。

③約20～30 min后，當雙蒸水和膠之間有一條分界線時，倒去膠上覆蓋的雙蒸水并用濾紙吸凈，注意兩端的水要吸凈。配濃縮膠，加入過硫酸銨(AP)、TEMED后立即搖勻迅速灌膠。灌滿濃縮膠，然后將干凈的梳子迅速插入濃縮膠中。灌膠及插梳子過程中要避免氣泡產生。待到濃縮膠凝固(30～40 min)后，將玻璃板固定于電泳裝置上(小玻璃板朝內，大玻璃板朝外)。先在電泳槽的內槽加滿電泳液(1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液)，然后雙手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將梳子拔出[6-7]。

第三步：上樣

測完蛋白含量后，計算含50μg蛋白的樣本體積即為上樣量。Marker 上樣量按說明書的推薦量，一般是3～5 μL。微量加樣器吸取樣品，上樣后用雙蒸水清洗微量加樣器，無菌紗布擦凈針頭上的雙蒸水。兩端加等體積的1×Loading buffer，以壓平電泳條帶。

第四步：電泳

將電泳裝置與電源相接，先恒壓60 V，待濃縮成一條直線時改為恒壓90 V(或110～130 V)，電泳至溴酚蘭到達分離膠底部上方約1 cm處時關閉電源，從Bio-Rad電泳裝置上卸下玻璃板，雙蒸水沖洗玻璃板，撬開玻璃板，切去濃縮膠及多余的分離膠。 剝離剩余的分離膠，轉移至1×轉膜液中漂洗。

1.4.5轉膜:跑膠時準備轉膜用品。1×轉膜液按1∶2∶7配方，即10×電轉液100 mL十200 mL甲醇十700 mL雙蒸水。轉膜液提前置于冰中預冷(此步很重要)。提前將NC膜或PVDF膜、海綿、濾紙一起浸泡入1×轉膜液中。

將夾子打開使白的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，在海綿墊上墊2層濾紙，NC膜凹面朝上放于濾紙上(此處要注意NC膜的方向性，否則蛋白質不能轉移到NC膜上)，將分離膠覆蓋于NC膜上，在膠上蓋2層濾紙，用玻棒搟走里面的氣泡，最后蓋上另一個海綿墊，再次用玻棒搟走里面的氣泡，合起夾子。整個操作在1×轉膜液中進行。裝有1×轉膜液的器皿整個操作過程均置于冰上。

將夾子放入電轉槽中，黑對黑，白對紅。4板膠電轉槽中1×轉膜液1 000 mL左右。電轉時會產熱，過熱有可能造成蛋白質的降解，同時大量產熱會使凝膠膨脹，有可能在膠和膜之間產生空隙，引起轉膜不均勻，所以在電轉槽中要放冰袋。電轉槽的3/4部分整個轉膜過程均置于冰水混合液體中。

1.4.6孵育抗體: ①轉移膜1×麗春紅中漂洗，蒸餾水中漂洗，剪下目的條帶并作好標記，轉至1×TBST液中，搖床上漂洗；②5%(w/v)脫脂奶粉封閉液室溫搖床上封閉目的條帶1 h；③5%(w/v)脫脂奶粉封閉液稀釋一抗，一抗孵育，4 ℃冰箱過夜；④1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min；⑤5%(w/v)脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，二抗室溫孵育2 h；⑥1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min。

1.4.7ECL化學發光凝膠成像:暗室中，將A和B兩種試劑在塑料管中1∶1體積混合，注意不能用同一槍頭吸取A和B試劑，每個目的條帶迅速加約200 μL ECL化學發光劑，按照化學發光凝膠成像系統操作說明書曝光，用凝膠圖像處理系統(AlphaView SA軟件)分析目的條帶和內參條帶的凈光密度值。

2 結果

Western blot實驗結果：大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表達增加(圖2和表4),與假手術組比較，缺血模型組(72 h)炎性因子IL-6, TNF-α顯著增加(P<0.001) , 結果表明IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子參與了大鼠心肌缺血的病理生理過程，炎癥加重心肌缺血損傷。

表4 大鼠心肌缺血前、心肌缺血后72 h炎性因子表達水平

注：數據以Mean±SEM表示，model vs. sham，#p<0.05，###p<0.001，n=6 Note: Mean±SEM, model vs. sham,#p<0.05,###p<0.001,n=6

圖2 大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表達增加炎性因子參與大鼠心肌缺血的病理生理過程

3 討論

Western blot為常用的檢測蛋白質的方法，其操作步驟較多[8]，大鼠心肌缺血炎性因子Western blot操作應該注意以下問題：①開胸摘取的心臟迅速置于0.9%生理鹽水中，離開大鼠的心臟在0.9%生理鹽水中仍能跳動并搏出心腔內的血液，待大鼠心臟搏動減弱時迅速置于另一個0.9%生理鹽水器皿中，直至生理鹽水顏色變淡，以避免紅細胞對A值的影響；②在冰袋上用眼科剪快速剪去左右心房、大血管及右心室大部分，將剩余的大鼠心臟組織一分為二(一份后續實驗，一份備份)，吸水紙(或無菌小紗布塊)將大鼠心臟組織水分吸干凈，樣本錫箔紙包裹(編號)存放于液氮罐中，待取材完畢轉到-80 ℃冰箱存放；③加裂解液RIPA的比例問題：大鼠心肌炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB)豐度低，Western blot預實驗發現按1∶6～7的比例較好，若按1∶5的比例裂解，條帶易顯示，但內參GAPDH條帶濃且易連成一條線，若按1∶9的比例裂解，條帶不易顯示；④一旦實驗計劃裂解心肌，需連續實驗至95 ℃ 10 min變性完畢這一步，實驗不要中斷，否則蛋白質易降解，導致內參GAPDH條帶不齊；⑤電泳槽的內槽應先加滿電泳液并觀察電泳槽內槽底端是否有電泳液漏出，若有電泳液漏出，則需重新夾緊玻璃板，作者實驗時曾出現過電泳完畢溴酚蘭不成一條直線而呈拱形，發現是因為電泳槽內槽漏液所致；⑥轉膜液一定要提前充分預冷。電轉槽的3/4部分整個轉膜過程均必需置于冰水混合液體中。10 min后電轉槽接通電源較好，此有利于整個轉膜體系溫度能夠提前降下來，低溫關系到轉膜的成敗；⑦大鼠心肌小分子量炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)Western blot轉膜條件為恒流250mA、1 h較好[9-10]，而大鼠心肌炎性因子(NF-κB，65kD，CST8242)Western blot轉膜條件為恒流400mA、1 h較好；⑧孵育一抗后以及孵育二抗后TBST洗膜，洗3次，每次10 min，這是最低要求，如果背景不干凈，建議增加TBST洗膜次數；⑨內參是Western blot不可或缺的，如果Western blot內參做不出，實驗無法進行下去。內參一般選擇管家基因編碼表達的蛋白，如β-actin、tubulin、GAPDH等。作者在檢測大鼠心肌蛋白時選用GAPDH作為內參。如果Western blot實驗，建議首先做一次所有標本的GAPDH，內參條帶如果不齊，建議重新定蛋白；⑩選擇好的一抗至關重要，盡量選擇單克隆抗體而不是多克隆抗體。