Scn3b在遺傳性糖尿病長爪沙鼠多種組織中的表達情況*

趙培琨 龔菁菁 杜小燕 李長龍 霍學云 路 靜 呂建祎 劉 欣 陳振文 郭 萌

(首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes mellitus)是當今全球范圍威脅人類健康的重大疾病之一，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后另一個嚴重危害人類健康的重要慢性非傳染性終身疾病。隨著國人生活方式發生改變和老齡化進程的加速，我國糖尿病的患病率呈現顯著上升趨勢。近年來，我國成人糖尿病患病率平均為11.6%，患病人數已達到1.14億[1]。其中2型糖尿病(T2DM)約占糖尿病患者數的90%[2]。2型糖尿病是由遺傳因素和環境因素共同作用的發病因素復雜的疾病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。2型糖尿病作為一種多基因控制的疾病，查找確定易感基因對于2型糖尿病發病的研究至關重要。通過糖尿病動物模型篩選易感基因成為研究的重要方法。長爪沙鼠具有獨特的解剖學、生理學特征，對于代謝性疾病具有極為重要的應用價值[4]。本課題利用自行培育近交系長爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通過抑制消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)的方法在糖尿病和正常血糖長爪沙鼠骨骼肌中發現控鈉通道β3亞基基因Scn3b差異表達。鈉離子通道是一種跨膜蛋白復合體，包含一個孔道結構的α亞基和一個或多個能夠調節通道狀態且能夠與其他多種蛋白互作的β亞基[5]。其中β3亞基由Scn3b基因編碼，廣泛分布于各種細胞膜，主要參與心臟電生理活動。但是其是否參與糖尿病的發生目前尚未知曉。因此，本文主要研究Scn3b在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌、腦組織和心臟中的表達情況，為探究長爪沙鼠糖尿病模型致病機制中Scn3b的作用和靶器官奠定基礎，從而為長爪沙鼠2型糖尿病模型發生機制的研究開拓新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取近交系自發糖尿病長爪沙鼠和對照正常血糖沙鼠，本文中分別用High和Control表示，每組各6只，雌雄各半，12～15周齡。所有長爪沙鼠均來自首都醫科大學實驗動物部，飼養于控制恒溫恒濕的普通環境中。動物自由飲普通水和采食，飼料購于北京科澳協力飼料有限公司。室溫為(22±2)℃，相對濕度40%～70%，人工光照明暗各12 h。

本實驗中所采用的兩組動物的空腹血糖數值如下：

空腹血糖mmol/L對照組4.9±1.0高血糖組6.7±0.7

糖耐量分別取0 h，0.5 h，1h和2 h的血糖數值，進行統計，結果如圖1。

圖1 糖尿病組和正常對照組長爪沙鼠的糖耐量試驗

1.2 樣品采集

動物施過量麻醉安樂死，解剖采集新鮮糖尿病模型和正常對照長爪沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織，之后立即置于液氮中。

1.3 RNA提取及cDNA制備

從液氮中各取出凍存的長爪沙鼠6種組織約30 mg分別移入均質管內，加入TRIzol試劑1 mL(Invitrogen，USA)和磁珠，剪碎后用均質器將組織徹底打碎，室溫放置1 min，加入200 μL三氯甲烷，混勻靜置15 min，4℃ 14 000 r/min 離心15 min，轉移上層液體至另一離心管，其中加入500 μL異丙醇，混勻靜置10 min，4℃ 14 000 r/min 離心15 min，棄去上清液。加入70%乙醇900 μL，洗滌沉淀，4℃12 000 r/min 離心10 min，棄去上清液。以上步驟重復1次。室溫自然干燥，加入適量的RNA-Free水溶解得到總RNA。利用Nanodrop 2 000c(Thermo scientific, USA)分析RNA濃度和純度。

cDNA的制備:利用快速反轉錄試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)對上述總RNA樣品進行逆轉錄。首先進行gDNA去除反應，5×gDNA Buffer 2μL，總RNA，去核酶水補足到10μL，42 ℃孵育3 min。之后進行反轉錄，10×Fast RT Buffer 2μL，FQ-RT Primer Mix 2μL，RT Enzyme Mix 1μL，去核酶水補足到10μL。此配好液體加入此前去除體系中，42 ℃孵育15min，95℃ 3min，得到相應的cDNA，-20 ℃保存。

1.4 Real-time PCR

按照SSH得到的Scn3b基因片段序列設計引物，利用 Primer Premier 5.0 設計PCR擴增引物多對。各組織選取Gapdh作為內參基因并設計引物。引物序列如表1所示，均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

表1 Real-timePCR引物序列

利用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上對Scn3b的mRNA水平進行檢測。所用試劑為實時定量PCR試劑盒(天根)，反應體系為20μL。反應條件如下: Real-time PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.6μL，模板cDNA 1μL，RNA-free H2O 7.8μL。反應程序均為: 95℃15min，之后95℃ 10 s，60 ℃ 30s，共擴增40個循環，每個循環結束時檢測熒光; 熔解曲線分析從60 ℃到95℃，每0.5 ℃檢測一次。

1.5 Western blotting

取液氮凍存的長爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織，剪碎后用組織蛋白提取試劑盒(康為世紀)提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。取30 μg總蛋白進行SDS-AGE凝膠電泳分離，電轉蛋白至硝酸纖維素膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脫脂奶粉(CST, USA)和0.05% Tween-20 封閉過夜。將膜與anti-Scn3b抗體(1∶1 000稀釋，abcam, USA)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，與二抗(辣根過氧化酶聯的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學發光法顯色。肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織做免疫印跡時內參基因選用Gapdh作為內參基因。最后用凝膠圖像分析系統(Bio-Rad)掃描蛋白質印跡條帶灰度。

1.6 統計方法

所有數據均利用SPSS 16.0軟件進行統計分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗方法分析。以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Scn3b基因在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4種組織中的表達差異

利用Real-time PCR法分別檢測糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織Scn3b的mRNA表達水平。如圖2所示，在肝臟組織中，糖尿病組Scn3b的mRNA表達水平顯著低于正常對照組，在骨骼肌和腦組織中，糖尿病組Scn3b的mRNA表達水平也具有低于正常對照組的趨勢。然而在腎臟中，糖尿病組和對照組間Scn3b的表達無差異。

2.2 Scn3b蛋白在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4種組織中的表達差異

Western Blotting檢測Scn3b蛋白在4種組織中的表達，結果顯示在肝臟中糖尿病組的蛋白表達水平顯著低于對照組，與Real-time PCR結果一致(圖3A)。而在腦組織中，Scn3b糖尿病組的蛋白表達水平也具有低于對照組的趨勢(圖3D)。然而，在腎臟和骨骼肌中，Scn3b在糖尿病組和對照組則無明顯差異(圖3B-C)。

圖2 Scn3b在糖尿病組和正常對照組長爪沙鼠4種組織中的mRNA表達水平

3 討論

糖尿病是一組由多種病因引起的，以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，全身多組織和重要器官的功能與代謝都會受到影響。本研究選取肝臟、腎臟、骨骼肌和腦組織進行分析。肝臟作為哺乳動物物質代謝最主要器官，參與三大類物質的代謝與轉化，通過肝糖原合成參與糖類代謝，對糖分調節、分布和轉化有重要意義，也是胰島素作用的重要靶器官[6]。骨骼肌作為葡萄糖與脂肪酸代謝器官，在胰島素作用下吸收血糖，緩沖血糖變化，對于全身糖代謝有重要意義。腎臟作為糖尿病主要受累器官，糖尿病會引發腎臟小血管病變，出現一系列腎臟功能不全的癥狀[6]。同時糖尿病還會累及腦組織，腦內線粒體利用葡萄糖，代謝產生的活性氧引起組織的氧化應激，造成腦組織的病理狀態[6]。因此我們選取這幾種組織作為研究的切入點。2型糖尿病在糖尿病人群中所占比例最高[7]，其發病機制作為近年來的研究重點，其中遺傳因素作為已知的最關鍵因素之一。所以尋找和確定易感基因成為2型糖尿病發病研究的關鍵所在,之后通過SSH從之前定向培育逐步形成的長爪沙鼠自發糖尿病模型動物群體的骨骼肌中，篩選出糖尿病組和正常組長爪沙鼠中的表達差異基因。本研究挑選出了其中可能與糖尿病和代謝相關的候選基因Scn3b進行不同器官組織表達分析。

此前有研究發現敲除α亞基Scn3a或調節型亞基Scn1b，能夠減少葡萄糖刺激引起的胰島素分泌[8-9]。因為胰腺β細胞是具有電生理活性的，胰島素的釋放依賴于動作電位的產生，通過電壓門控鈣離子通道活化,胞內鈣離子濃度增加，激發胰島素囊泡向胞外釋放[10-12]。然而，Scn3b在糖尿病靶組織中的作用卻尚無報道。在本實驗中，我們發現，Scn3b在糖尿病組肝臟和腦組織中mRNA和蛋白水平均下降且與SSH趨勢一致。肝臟參與維持血糖的穩定，在胰島素作用下抑制糖原分解，促進糖原合成。在糖尿病組動物肝臟中Scn3b的mRNA和蛋白水平的顯著下降，提示Scn3b可能參與肝臟血糖分解代謝與糖原合成，其異常降低可能與糖異生異常相關。腦組織以葡萄糖作為最主要的供能物質，作為機體代謝最旺盛的器官，也是葡萄糖代謝的另一重要場所。糖尿病動物腦組織中Scn3b的mRNA和蛋白水平也有一定下降趨勢，我們推測Scn3b可能也與腦組織血糖代謝與利用有關。以上結果提示，肝臟和腦組織可能是Scn3b基因參與糖代謝的靶器官。

總之，長爪沙鼠糖尿病模型中Scn3b的表達變化，顯示出其與糖尿病發生可能具有相關性，尤其是在肝臟和腦組織中，這為糖尿病發病的分子機制研究以及進一步深入研究2型糖尿病的防治提供一個新的研究角度。