內質網應激對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織的作用

王晶晶 張 杰 盧 靜

(1. 首都醫科大學實驗動物部，北京 100069)(2. 首都醫科大學公共衛生學院臨床流行病學北京市重點實驗室，北京 100069)

心力衰竭(heart failure，HF)是各種嚴重心臟疾病共有的一個主要并發癥或“最后共同通道”。心力衰竭患者一旦出現典型癥狀，病情將進行性加重，死亡率與惡性腫瘤病人相仿[1-2]，但目前對于其機制、診斷和治療的認識還遠遠不夠。隨著研究的不斷深入，發現心肌細胞的不正常凋亡在心衰中起著重要的作用[3-4]。同時發現內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是使心肌細胞不正常凋亡的新途徑。本實驗通過建立大鼠急性心肌梗死模型,觀察心肌梗死后心力衰竭大鼠8周內內質網特異性分子伴侶的表達變化與心衰大鼠心肌細胞凋亡的關系,探討急性心肌梗死后大鼠心力衰竭的過程中，內質網應激在心肌細胞凋亡中的作用，從而為心衰病人的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量200～220 g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001；飼養于首都醫科大學實驗動物中心SPF級實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2013-0004。

動物經適應性喂養一周后，隨機分為假手術組，手術組。假手術組僅進行開胸手術，不結扎冠脈，隨機分0周組、2周組、4周組、6周組、8周組，每組存活動物不低于5只。手術組根據參考文獻[5-7]的方法，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，肢體導聯出現1個明顯的ST段弓背抬高，心肌梗死模型成功，模型成功率為98%。手術組術后隨機分為術后2周組、4周組、6周組、8周組共4組，每組存活動物不低于5只。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNA反轉錄試劑盒(Promege公司)，QPCR試劑盒(ABI公司)、引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。

EL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟生物科技有限公司，國產)，熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司，IQ5美國)、高速冷凍離心機(Thermo公司，德國)。

1.3 方法

1.3.1血流動力學指標測定：分別測定假手術組各組在0周、2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)；測定手術組術后2周組、術后4周組、術后6周組、術后8周組大鼠在2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)。

1.3.2心肌組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA：手術組術后2周組、4周組、6周組、8周組大鼠分別于術后2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織；假手術組大鼠分別在0周、2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織。采用Trizol試劑[6-7]分別提取假手術組各組大鼠、手術組各組大鼠的心肌組織中總RNA，利用RNA反轉錄試劑盒將心肌總RNA反轉錄為cDNA。

1.3.3引物設計：引物根據GenBank數據庫中的基因組序列，利用生物學軟件Primer5.0自行設計。

表1 引物序列

1.3.4熒光定量PCR法(QPCR)測定Caspase-3, Caspase-12, Bcl-2，CHOP, GRP78在心肌組織中的的表達量：利用QPCR反應試劑盒(SYBR GREEN法)采用20 μL反應體系。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min，95℃10 s，55℃30 s，40個循環。PCR產物應用隨機軟件進行分析得到相關的光密度值。每個樣本做3平行樣，最后取基因或蛋白的光密度值與相應的β-actin光密度值的比值進行分析。

1.4 統計方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，組間的數據比較采用S-N-K 檢驗，蛋白及基因的表達量與時間的相關性分析采用Speaman相關。檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 血流動力學測定

假手術組大鼠2、4、6、8周的血流動力學各項指標與該組0周時的相比均無統計學意義(P>0.05)，結果見表2；手術組大鼠的心率隨著飼養時間的增長逐漸加快，術后2周、4周、6周、8周組大鼠左心室收縮壓(LVSP)與假手術組的相比有明顯下降，差異有統計學意義(P≤0.01)；手術組大鼠術后2周、4周、6周、8周組的左心室收縮壓(LVEDP)與假手術組相比明顯升高，差異有統計學意義(P≤0.01)；手術組術后2周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比差異有統計學意義(P≤0.05)，手術組大鼠術后4周、6周、8周組與假手術組的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比有明顯下降，差異有統計學意義(P≤0.01)；手術組術后2周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比差異有統計學意義(P≤0.05)，手術組大鼠術后4周、6周、8周組與假手術組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比有顯著下降，差異有統計學意義(P≤0.01)，結果見表3。

2.2 不同組的大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78的表達

手術組大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-12的表達量隨著飼養時間的延長表達量增加，與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.01)；手術組大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-3的表達量隨著飼養時間的延長表達量增加，術后4、6周組與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.05)，術后2、8周與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.01)；大鼠手術組術后2、4、6、8周組心肌組織中Bcl-2的表達量隨著術后飼養時間的延長而降低，2、4、6、8周組與假手術組相比差異有統計學意義P≤0.01)；大鼠術后2、4、6、8周組心肌組織中CHOP的表達量隨著飼養時間的延長表達量增加，術后2、4周組與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.01)，術后6、8周組與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.05)；大鼠手術組術后2、4、6、8周組心肌組織中GRP78蛋白的表達量隨著飼養時間的延長表達量增加，術后6周組與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.05)；術后8周組心肌組織中的GRP78蛋白含量與假手術組相比差異有統計學意義(P≤0.01)，結果見表4。

表2 假手術組大鼠不同時間的血流動力學檢測結果

注：A：與假手術組比P≤0.05； AA：與假手術組比P≤0.01 Note：A:P≤0.05vssham group, AA:P≤0.01vssham group

表4 各組大鼠心肌組織基因/蛋白含量表達

注：A：與假手術組比P≤0.05； AA：與假手術組比P≤0.01 Note：A：P≤0.05vssham group，AA：P≤0.01vssham group

2.3 術后飼養2、4、6、8周與手術組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78含量的相關性

手術組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3，CHOP, GRP78的表達量隨著術后飼養時間的增長而增加，其表達量與時間呈正相關，心肌組織中Bcl-2的表達量隨著術后飼養時間的增長而減低，其表達量與時間呈負相關，結果見表5。

表5 大鼠術后飼養時間與大鼠心肌組織中蛋白/基因表達量的相關性

3 討論

心力衰竭是心臟結構與功能嚴重減退的臨床表現，然而對心肌梗死后心力衰竭的發生、發展機制仍未完全闡明。急性心肌梗死后心肌細胞的死亡會導致心室重塑和心力衰竭，而心室重構的發生與心肌細胞凋亡又有著重要聯系。研究顯示心肌細胞凋亡在心肌梗死后心室重塑和心衰發展中發揮重要作用,而心肌細胞凋亡與內質網應激的發生又密切相關[8-9]。

內質網是廣泛存在于真核細胞內的重要細胞器，當機體受到如缺氧、中毒、電解質酸堿平衡紊亂等刺激時，其相應的跨膜信號傳導蛋白將會被激活，破壞內質網內環境的穩定，抑制內質網蛋白質合成功能，誘導細胞發生內質網應激[10-11]。內質網應激早期,是通過激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)保護由ERS引起的細胞損傷，恢復細胞功能恢復內質網穩態，維持細胞的正常功能并使之生存，是細胞的一種自我保護性機制。

UPR是由內質網分子伴侶GRP78/Bip (glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein)和內質網上PERK、ATF6、IRE1應激感受蛋白所介導發生的。正常情況下GRP78與PERK、ATF6、IRE1連接呈無活性狀態，當內質網內積聚大量未折疊蛋白時,GRP78與三者解離，激活PERK、ATF6、IRE1，啟動UPR反應，從而對細胞起到保護作用。因此GRP78在應激條件下對細胞起保護作用,而它的誘導產生則被廣泛用于標志ERS和UPR的發生[12]。

本實驗中發現急性心肌梗死后心力衰竭的大鼠心肌組織中GRP78蛋白持續表達，并隨著術后飼養時間的延長，心力衰竭的嚴重程度增強。這說明在急性心肌梗死到心力衰竭的病理過程中內質網應激反應被激活。這可能是由于急性心肌梗死的大鼠在發展成慢性心力衰竭的過程中，隨著大鼠心肌細胞的缺血，心臟輸出量降低，心臟功能減弱，使得內質網負荷逐漸加重，從而誘導了ERS和UPR反應的發生。

大鼠在發生急性心肌梗死后發展到心力衰竭的過程中，體內的ERS持續存在，過強或過久的ESR，使得UPR的保護作用不能與ESR帶來的損傷相抗衡。由于不能通過UPR的啟動恢復細胞正常功能，內質網上與ERS相關的跨膜蛋白信號將會激活下游的凋亡信號分子：Caspase-12，GADD153/CHOP(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153或C/EBP homologous protein)，從而導致心肌細胞凋亡[13]。已有的研究表明，內質網應激是除了線粒體外，另一條誘導細胞凋亡的新途徑，過強的或長時間的ERS反應可以引起細胞凋亡[14-15]。

Caspase-12是內質網膜獨有的蛋白水解酶，特異性結合于內質網膜上。正常情況下以無活性的前提存在，當發生ESR時Caspase-12被激活，進而激活下游的Caspase-3，從而誘導細胞凋亡的發生。實驗證明Caspase-12是內質網應激誘導凋亡的特異性分子，是不通過線粒體凋亡途徑的獨立信號轉導途徑介導細胞凋亡的[15-16]，因此可以把Caspase-12的活化作為ERS途徑細胞凋亡的標志[15]。

而GADD153/CHOP是b-ZIP轉錄因子,屬于CCAATP增強子連接蛋白的轉錄因子C/EBP家族，在正常生理狀態下CHOP基本檢測不到，當內質網應激持續時間過長或程度過重時，其活性被顯著激活，引發高水平的ERS[16]。 因此CHOP是內質網應激的標志，它是是通過下調Bcl-2表達、耗竭谷胱甘肽、促進反應氧族產生等導致細胞凋亡。

我們在實驗中發現心肌梗死后心力衰竭的大鼠術后2周、4周、6周、8周組的心肌組織中Caspase-3,Caspase-12，CHOP 的表達量隨著術后飼養時間的延長，心力衰竭的嚴重程度而增加。Bcl-2的表達量隨著術后飼養時間的延長，心力衰竭的嚴重程度而減少。這說明大鼠從心肌梗死發展到心力衰竭的過程中，內質網上始終有ESR的發生。持續存在的ESR，使與內質網相關的凋亡信號分子被激活，引發心肌細胞凋亡，并使細胞凋亡貫穿于心肌梗死到心力衰竭的整個過程。

綜上所述，大鼠從急性心肌梗死發展到心力衰竭的病理生理過程誘導了內質網應激的發生，持續、嚴重的內質網應激激活了與內質網應激相關的細胞凋亡通路，使得心肌細胞凋亡。提示ERS參與了大鼠從急性心肌梗死到心力衰竭發生、發展過程。內質網應激誘導的心肌細胞凋亡作用可能是心肌梗死后導致心力衰竭發生的機制之一。