長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群體生物學(xué)特性的初步研究*

馬蘭芝 杜小燕 尚世臣 崔曉霞 李 迎,3 黃 斌 尚玉璞 李桂軍 王冬平 陳振文

(1.軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心， 北京 100071)(2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)(3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

長爪沙鼠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為實驗動物應(yīng)用研究已有60余年的歷史。其獨特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)特征對于特殊研究項目具有重要價值，尤其沙鼠固有的特征，繁殖的沙鼠腎上腺皮質(zhì)固醇(主要是糖皮質(zhì)固醇)分泌亢進，同時伴有高血糖癥等備受重視[1]。Boquist在長爪沙鼠群中發(fā)現(xiàn)了部分(37.14%)肥胖并且伴有空腹血糖升高和糖耐量下降的個體，Vincent發(fā)現(xiàn)在常規(guī)飼養(yǎng)狀態(tài)下出現(xiàn)肥胖的長爪沙鼠群體中，部分個體表現(xiàn)出糖耐量受損、血清胰島素有免疫反應(yīng)和胰腺等多臟器出現(xiàn)糖尿病特征[2]。首都醫(yī)科大學(xué)以空腹血糖和OGTT2h血糖值為篩選指標，進行近交選育繁殖。目前已經(jīng)到達F20代，本研究針對F20～F21代長爪沙鼠的血液生理生化、遺傳生化位點標記和生長繁殖特性等進行初步探討，為長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群體的生物學(xué)特性研究和數(shù)據(jù)庫提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為其特性和應(yīng)用研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群F20～21代動物，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SYXK(京)-2013-0005]，實驗動物自由采食和飲水，室溫為20～24 ℃。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物和動物實驗倫理委員會批準(No.AEEI-2017-032)

1.2 儀器設(shè)備及主要試劑

生化數(shù)據(jù)使用Beckman全自動生化分析儀(CX5 PRO)及其配套試劑，為Beckman公司提供生產(chǎn)的；血細胞計數(shù)使用日本光電全自動血細胞分析儀(MEK-7222 K)及其配套試劑，為上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)；離心使用日本HITACHI公司低溫離心機(CF16RX)；DYY-Ⅲ-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYY-Ⅲ-38B電泳槽；DYY-Ⅰ玻璃組織勻漿機；脫色搖床(GFL3018)；超級加樣器(WD-9404)，醋酸纖維板購于北京六一儀器廠；染色試劑均來自于美國Sigma公司，常規(guī)生化試劑為分析純；大小鼠的標準品購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法

1.3.1血液標本采集和處理： 實驗前動物空腹12～24 h，自由飲水。眼眶靜脈取抗凝血(1%的肝素)和全血， 全血靜止 30 min，5 000 r/min離心10 min 制備血清備用。抗凝血測定血細胞之后，5 000 r/min 離心10 min 制備血漿，血細胞加入蒸餾水(1∶0.5)，震蕩制備溶血素。動物頸椎脫臼處死，剖腹取心臟、肺臟、腎臟、胰腺、睪丸，放入5 mL EP管中，按1∶1的比例添加蒸餾水，用組織勻漿機研磨，置于低溫高速離心機10 000 r/min離心60 min，吸取上清液備用, -20 ℃冰箱保存。

1.3.2測定指標： 血液生化指標17項：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(URIC)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMY)、鎂(Mg)以及葡萄糖(GLU)。血細胞指標22項：白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(NEUT)、單核細胞(MON)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BAS)、淋巴細胞百分比(LYM%)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、單核細胞百分比(MON%)、嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細胞百分比(BAS%)、紅細胞(RBC)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞體積分布寬度(RDW)、血紅蛋白(HGB)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板平均體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)。遺傳生化位點標記26個：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-1(Gpd-1)、酯酶-3(Es-3)、碳酸酐酶-2(Car-2)、堿性磷酸酶-1(Akp-1)、異檸檬酸脫氫酶-1(Idh-1)、蘋果酸酶-1(Mod-1)、磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)位酶-1(Pgm-1)、腎過氧化氫酶-2(Ce-2)、肽酶-3(Pep-3)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶-1(Gpi-1)、血紅蛋白-β鏈(Hbb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、酯酶-1(Es-1)、酯酶-10(Es-10)、甘油磷酸脫氫酶-1(Gdc-1)、β-葡萄糖苷酸酶-1(Gus-1)、酯酶-2(Es-2)、乳酸脫氫酶調(diào)節(jié)體-1(Ldr-1)、血清蛋白-1(Sep-1)、淀粉酶-1(Amy-1)、酯酶-6(Es-6)、酯酶-8(Es-8)、酯酶-9(Es-9)、酯酶-4(Es-4)、過氧化氫酶-1(Cs-1)、酯酶-12(Es-12)。

1.3.3繁殖特性：采用F20-21代成年長爪沙鼠9對，按照近交系動物生產(chǎn)繁殖原理，取一雌一雄長期同居交配方式繁殖飼養(yǎng)。在記錄卡片上記錄交配日期，出生日期，產(chǎn)仔數(shù)，死亡數(shù)，離乳仔鼠數(shù)，離乳仔鼠體質(zhì)量，統(tǒng)計初產(chǎn)日齡，產(chǎn)仔胎數(shù)等繁殖信息。

1.3.4生長發(fā)育觀察：自出生之日起逐日進行觀察，記錄初生體質(zhì)量，第一周，每天稱量仔鼠體質(zhì)量，以后每周稱量體質(zhì)量至第八周。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，使用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析對測得的實驗數(shù)據(jù)進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 血液生化測試結(jié)果

應(yīng)用3～4月齡糖尿病近交系長爪沙鼠雌性7只和雄性14只測得血液生化指標17項，統(tǒng)計結(jié)果顯示：長爪沙鼠糖尿病近交系雌雄之間生化指標ALP、HDL-C、CRE差異極顯著(P<0.01)；GLU、TG、LDH、差異顯著(P<0.05)，其它指標差異不顯著(見表1)。

表1 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群血液生化指標雌雄之間的比較

注：**雌雄比較差異極顯著，P<0.01；*雌雄比較差異顯著，P<0.05 Note:**the male and female comparison difference was very significant,P<0.01;*the male and female comparison difference was significant,P<0.05

2.2 血液生理指標測試結(jié)果

應(yīng)用3～4月齡長爪沙鼠糖尿病近交系雌性7只和雄性14只測得血液生理指標22項，統(tǒng)計結(jié)果顯示：長爪沙鼠糖尿病近交系血液生理指標雌雄之間比較MCV、MCH、EOS差異顯著P<0.05，其它指標差異不顯著(見表2)。

表2 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群血液生理指標雌雄之間的比較

注：*雌雄比較差異顯著，P<0.05 Note:*the difference between male and female was significant,P<0.05

2.3 糖尿病近交系長爪沙鼠生化基因位點遺傳質(zhì)量分析

應(yīng)用已經(jīng)建立的方法[3]檢測長爪沙鼠糖尿病近交系培育群遺傳生化位點標記26項，20只動物檢測結(jié)果顯示26個生化位點標記呈現(xiàn)單一性(見表3)。

2.4 繁殖性能

2.4.11～5胎窩產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重和初生仔鼠平均重的比較

9對繁殖種鼠統(tǒng)計結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病近交系1～5胎的出生數(shù)、初生窩重和初生平均重量差異不顯著(見表4)。

表3 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群遺傳生化位點標記(n=20)

表4 1～5胎窩產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重和初生仔鼠平均重的比較

2.4.2離乳均重、成年體質(zhì)量和離乳成活率

離乳動物的體質(zhì)量及離乳成活率、8周齡的成年體質(zhì)量進行測試和統(tǒng)計，其結(jié)果如下(見表5).

表5 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群的成年體質(zhì)量和離乳均重及成活率

2.4.3繁殖群體不同的胎間隔比較

選取近交F20代的種鼠9對進行交配繁殖，進行胎間隔的觀察統(tǒng)計，胎間隔在20～157 d之間，胎間隔2和3的標準差較大，說明在繁殖第3、4、5胎的胎間隔差異很大(見表6)。

表6 長爪沙鼠糖尿病模型近交系培育群繁殖的胎間隔

2.5 生長曲線

長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～7 d的生長曲線：R=0.9887，決定度R2=0.9776，在該段時間內(nèi)影響體質(zhì)量增加的因素中日齡起了97.76%的作用；長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～8周的生長曲線：R=0.9921，決定度R2=0.9842，在該段時間內(nèi)影響體質(zhì)量增加的因素中周齡起了98.4%的作用,(見圖1)。

圖1 長爪沙鼠糖尿病模型近交系動物的生長曲線

3 討論

長爪沙鼠糖尿病模型近交系是在進行長爪沙鼠近交系培育過程中，發(fā)現(xiàn)一個分支的動物有空腹血糖較高的現(xiàn)象，經(jīng)過對糖尿病相關(guān)指標篩查、選種進行兄妹交配培育而育成的，目前已經(jīng)達到F20代。本研究對長爪沙鼠糖尿病模型近交系的遺傳生化位點標記和部分生物學(xué)特性進行初步研究，這些特性為長爪沙鼠糖尿病模型近交系進一步標準化、鑒定和應(yīng)用提供依據(jù)。

實驗動物血液生化和生理參數(shù)主要是受到動物自身遺傳因素的控制，并且受諸多因素的影響[4 ]。正常的血液生理生化指標在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中是重要的指標, 是病理學(xué)、毒理學(xué)等研究的重要參考依據(jù)[5]。本研究測得血液生理生化結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病模型近交系雌雄之間生化指標ALP、HDL-C、CRE差異極顯著(P<0.01)；GLU、TG、LDH、MCV、MCH、EOS差異顯著(P<0.05)。GLU值均高于5.0，雄性比雌性的高。文獻報道[6]的CMU/1近交系長爪沙鼠雌雄之間GLU、CRE、PLT、MPV、BAS、LYM%差異顯著，CMU/1近交系長爪沙鼠雌雄之間TG、PDW差異極顯著，CMU/2近交系長爪沙鼠雌雄之間CHOL、HCT、MCV、MCH差異顯著，與本文結(jié)果一致。

近交系動物基本的特征是遺傳基因高度純合、表型一致，實驗結(jié)果重復(fù)性好等，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域[7]。本研究中長爪沙鼠糖尿病模型近交系的26個生化位點標記電泳表型一致，未發(fā)現(xiàn)雜合型和多態(tài)性，說明這個近交系動物在上述位點均已純合，已選的26個生化標記純合度達到100%。與文獻報道[3]的CMU/1近交系長爪沙鼠的生化位點標記一致。

9對繁殖種鼠統(tǒng)計結(jié)果：長爪沙鼠糖尿病模型近交系1～5胎的出生數(shù)、初生窩重和初生平均重量差異不顯著；胎間隔在20～157 d之間，胎間隔2和3的標準差較大，說明在繁殖第3、4、5胎的胎間隔差異很大；分窩體質(zhì)量為26.5～38.48 g,8周的體質(zhì)量為45.88～56.90 g，離乳率為 68.31%，文獻報道[8]CMU/1的分窩體質(zhì)量為24.73～37.33 g，8周的體質(zhì)量為44.42～54.78 g，離乳率為74.46%；CMU/2的分窩體質(zhì)量為27.39～39.29 g，成年體質(zhì)量為47.88～57.40 g，離乳率為73.92%。比較長爪沙鼠糖尿病模型近交系繁殖性能與CMU/1基本一致，只是離乳率偏低，生長發(fā)育比CMU/2弱。

本文描述長爪沙鼠糖尿病模型近交系的生物學(xué)特性，為品系鑒定、保種繁殖和應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。