調節青少年特發性脊柱側凸患者椎旁肌改變的關鍵微RNA

張 珂，姜 橫，孟怡辰，周許輝

海軍軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海 200003

青少年特發性脊柱側凸（AIS）是最常見的脊柱畸形，其病因未明［1］。椎旁肌的不平衡在AIS的發生和進展中具有重要作用［2］。有文獻報道，AIS患者兩側椎旁肌的肌電活動和肌纖維類型存在差異，且與患者的側凸角度進展相關［3］。本研究組前期通過影像學測量發現，AIS患者兩側椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱［4］。另有研究顯示，AIS患者兩側椎旁肌褪黑素受體和轉化生長因子-β信號通路相關分子表達不對稱，但對于上述椎旁肌的復雜改變的分子機制仍鮮有報道［5-6］。

微RNA（miRNA）通過調控基因表達在多種生物過程中發揮重要作用［7］。研究顯示，一些肌肉特異性miRNAs能調節肌肉的各項功能，包括成肌細胞增殖、分化、收縮性能和壓力反應等［8-9］。另外，肌肉特異性miRNA也與心臟肥大、心力衰竭、心律失常、先天性心臟病和肌營養不良等肌肉相關性疾病密切相關［10-11］。因此，本研究欲探尋調節患者椎旁肌改變的關鍵miRNA及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月—2016年9月本院收治的漢族女性AIS患者30例。納入標準：①AIS診斷明確；②側凸Cobb角＞ 40°；③臨床資料和影像學資料完整；④不伴椎間盤突出、峽部裂等其他脊柱疾病，既往無針對肌肉功能治療史或其他脊柱手術史。所有患者均被告知研究內容并簽署知情同意書。凹側與凸側椎旁肌組織為盡量遠離電刀處理過的多裂肌組織500 ～ 1 000 mg（約黃豆大小），去除壞死組織和殘留血漬后置入凍存管，并迅速置于液氮罐內保存。

1.2 影像學測量和臨床數據

所有患者術前拍攝標準站立位脊柱全長正側位X線片，測量側凸Cobb角并記錄頂椎位置。使用電子病歷收集患者臨床信息，包括手術年齡、月經初潮時間、是否進行過支具或牽引等治療。

1.3 miRNA高通量測序

取其中3例在發病年齡、手術年齡、Lenke分型、角度大小、Risser征等參數相匹配的患者凹側和凸側椎旁肌組織，提取總RNA，測定RNA純度與質量，在5’和3’端分別連接接頭序列，形成帶有接頭的單鏈RNA，反轉錄生成RNA/DNA雜交鏈，PCR擴增構建small RNA-seq cDNA文庫，采用illumina Hiseq測序平臺（上海晶能生物有限公司，中國）單端測序模式進行高通量測序。

1.4 實時熒光定量PCR

取其余27例患者的椎旁肌組織，驗證高通量測序的質量及差異miRNAs的表達情況。使用TRIzol（Invitrogen公司，美國）提取椎旁肌組織總RNA，用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司，美國）測定RNA濃度與純度。采用SYBR GreenⅡ20 μL體系擴增miRNA。具體反應體系、反應程序根據試劑盒說明書設定（TaKaRa公司，日本），以U6 snRNA作為內參。實時熒光定量PCR反應條件：95℃起始激活3 min；95℃變性12 s、62℃退火40 s、72℃延伸45 s，40個循環；最終72℃延伸5 min。采用ΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.5 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學分析。兩側椎旁肌組織相關miRNA表達水平的比較采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗。采用Pearson相關性分析對兩側miRNAs相對表達量的差值與患者臨床信息（手術年齡、術前側凸Cobb角）的關系進行分析，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

由miRNAs聚類熱圖（圖1）可知，AIS患者凹側和凸側椎旁肌存在差異表達miRNA。共有18個miRNA表達有差異，其中凹側較凸側表達量增加的12個，增加倍數最大的是miR-424；凸側較凹側表達量增加的6個，增加倍數最大的是miR-517（表1）。

圖1 AIS患者兩側椎旁肌組織差異miRNA聚類熱圖（n=3）Fig. 1 MiRNAs clustering thermal map of bilateral paraspinal muscles in AIS patients（n=3）

表1 AIS患者兩側椎旁肌miRNA表達差異Tab. 1 Differences in miRNAs expression between bilateral paraspinal muscles in AIS patients n=3

為驗證高通量測序的質量和測序篩選獲得差異miRNAs的表達情況，在27例AIS患者兩側椎旁肌組織中對測序結果中變化倍數最大的6個miRNA進行表達驗證，分別為凹側含量較高的miR-424、miR-433、miR-769和凸側含量較高miR-516、miR-517、miR-495。目標miRNA的相對表達量（ΔCt）=Ct目標miRNA表達量-CtU6。實時熒光定量PCR結果顯示僅miR-516、miR-517和miR-495的表達差異具有統計學意義（P＜ 0.05，圖2）。

相關性分析顯示，兩側椎旁肌miR-516相對表達量差值與患者發病年齡呈負相關（r=-0.452），miR-517相對表達量差值與側凸Cobb角呈負相關（r=-0.378）。

圖2 AIS患者兩側椎旁肌差異表達miRNA驗證（n=27）Fig. 2 Veri fi cation of differential expression of miRNAs in bilateral paraspinal muscles of AIS patients（n=27）

3 討 論

AIS患者側凸角度有進展風險，目前臨床上主要處理措施是佩戴支具預防角度進展，針對大角度的側凸進行手術矯形。患者隨訪檢查接受的輻射、高昂的手術費用和繼發的心肺功能障礙造成了巨大的社會負擔［12］。對AIS發生機制的深入研究有助于更好地為疾病的診斷、治療甚至預防提供新思路。由于遺傳異質性和缺乏合適可靠的動物模型，目前AIS的病因和病理機制尚未明確［13］。有學者認為，在AIS的發生和進展中，椎旁肌組織的代償性功能能維持脊柱的穩定性，當肌肉力量不足時，椎體內在的旋轉不穩定導致側凸角度增大［2，14-15］。上述研究主要從功能學和形態學方面闡述AIS患者兩側椎旁肌的不對稱，卻未對產生這種改變的分子機制進行闡述。本研究通過RNA高通量測序發現AIS患者兩側椎旁肌miR-516、miR-517、miR-495存在差異表達，且miR-516的相對表達差值與患者手術年齡呈負相關，miR-517的相對表達差值與患者側凸Cobb角呈負相關。

有研究報道，在凹側椎旁肌表達升高的miR-495與骨骼肌的再生關系密切［16］。miR-495位于Gtl2-Dio3基因座［17］，Gtl2-Dio3編碼的miRNA能抑制分泌型卷曲相關蛋白（sFRP）的分泌，后者是Wnt信號轉導通路的抑制劑。動物實驗表明Gtl2-Dio3編碼的miRNA（包括miR-495）在再生MEF2A敲除肌組織中表達下調，導致sFRP的表達上調和Wnt信號通路的活性減弱［18］。因此，miR-495在MEF2A的調控下對Wnt信號轉導的調節在骨骼肌的再生過程中發揮重要作用。

miR-516和miR-517共同位于C19MC基因簇內［19-20］。有研究表明，該基因簇內的miRNA在成體組織中的表達量均較小［21］，而在早期胚胎發育過程中顯著高表達［22］。該基因簇內的miRNA的調控功能大多與腫瘤的發生相關［23］。目前miR-516和miR-517在骨骼肌發育或AIS的發生、發展過程中的作用尚未見報道。

本研究組前期發現AIS患者兩側椎旁肌的肌容積和脂肪浸潤率不對稱［4］，本研究結果提示兩側椎旁肌中與骨骼肌再生相關的miRNA表達存在差異，推測在應力或青春期各種內外因素的作用下，兩側椎旁肌的miRNA表達發生改變，異常表達的miRNA通過調控特異性靶基因的表達而引起肌細胞生長發育和其他功能的變化，導致兩側椎旁肌收縮性能出現差異，最終引起側凸的出現或加重。miRNA在AIS患者兩側椎旁肌中差異表達的機制仍需進一步研究，以解釋其介導椎旁肌不平衡改變的作用機制。