樹鼩糞便中病毒三種濃縮方法的效果比較*

陳玲霞 尹博文 苗雨潤 宋慶凱 李曉飛 代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，樹鼩種質資源中心，昆明 650118)

腸道食源性病毒傳播途徑為傳染源-糞便-水體或食品-人，根據其致病類型可將其分為3種:引起胃腸炎的病毒，如杯狀病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒；肝炎病毒，包括甲肝病毒，戊肝病毒；引起其他疾病類型的病毒，如腸道病毒[1]。糞便污染水質樣本，經水傳播病毒導致人體感染的病例時有報道，已經引起人們的廣泛關注[2-3]。對糞便中的病毒進行快速有效的檢測，是阻斷病原體傳播的關鍵。高通量測序技術能夠快速地鑒定出標本中存在的病毒,已形成了一門研究特定環境中病毒群落的新興學科：病毒宏基因組學。但由于野生樹鼩糞便中所含病毒豐度通常很低，而病毒宏基因組學需要獲得足夠的病毒核酸用于測序，為保證檢測結果的質量，需要對樹鼩糞便中的病毒進行預先富集濃縮。病毒的富集方法繁多，主要包括超濾法、吸附洗脫法、絮凝沉淀法等。病毒富集方法的選擇與樣品類型有關，國內外多數用于水體中病毒的濃縮富集，Rutjes等[4]使用膜吸附洗脫法濃縮水樣病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀病毒結合超聲分離以濃縮火雞腸道組織的病毒，John等[6]采用鐵離子絮凝的化學方法濃縮富集海洋病毒；國內寇曉霞等[7]采用三氯化鋁和膜吸附法研究了不同水體的病毒濃縮回收率，徐露等[8]比較了鈣離子法、牛肉湯洗膜法和載陽電荷濾料法對水體中病毒的濃縮效果。目前暫無研究報道針對糞便樣品中的病毒濃縮方法。鑒于糞便樣品的雜質含量多，超濾和膜吸附等方法容易堵塞，所以本文選擇沉淀濃縮病毒的方法，即PEG沉淀結合超聲分離法、鐵離子絮凝的化學方法和GBviroFast病毒濃縮試劑盒等三種病毒濃縮方法。利用實時熒光定量PCR檢測含有指示病毒TRV的模擬糞便上清，評價這三種病毒濃縮方法用于糞便中病毒濃縮的效果，為進行腸道病毒宏基因組學研究選擇最佳的病毒富集濃縮方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生馴化樹鼩，來源于醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。實驗操作在醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心實驗設施進行[SYXK(滇)K2013-0001]。

1.2 實驗設備和試劑

試劑：PBS(購自Thermo)、生理鹽水(購自四川科倫藥業)、PES膜過濾器(購自Millipore)、PEG-6000(購自國藥集團化學試劑有限公司)、Fecl3·6H2O(購自BBI Life Sciences)、GBviroFast病毒濃縮試劑盒、QIAamp Viral RNA Mini Kit、TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、TRV為指示病毒(本實驗室分離保存)。

儀器：CJJ78-1磁力加熱攪拌器、JY92-IIN超聲波細胞粉碎機、CT15RE低溫離心機、CFX96TMReal-Time PCR Detection System擴增儀。

1.3 方法

1.3.1加標糞便上清的制備:采取野生馴化樹鼩的新鮮糞便30份于40個EP管中，加PBS 1 mL/管，充分渦旋混勻，12 000 r/min離心30 min，取上清，經0.45、0.22 μm PES膜進行過濾，得濾液30 mL，分成3份，每份10 mL糞便上清加入TRV懸液140 μL。

1.3.2病毒濃縮方法

1.3.2.1 PEG-6000沉淀結合超聲分離法:按W/V8%加PEG-6000至配置好的10 mL糞便上清，4 ℃攪拌過夜，12 000 r/min于4 ℃離心30 min，收集沉淀，4 ℃保存，上清經PEG-6000重復沉淀，將兩次收集的沉淀懸浮于500 μL的冷生理鹽水；對懸液進行超聲5 min，超聲5 s、停歇5 s、30個循環，超聲后經12 000 r/min離心5 min，沉淀PEG顆粒，將上清移至新EP管。

1.3.2.2 鐵離子絮凝法:取4.83 g Fecl3·6H2O加至1 L蒸餾水，配置成Fe3+濃度為1 g/L的溶液；取配置的溶液10 μL加入配置好的10 mL糞便上清，Fe3+終濃度為1 mg/L，充分混勻，4 ℃過夜；12 000 r/min于4 ℃離心30 min，收集沉淀，將沉淀懸浮于500 μL生理鹽水中。

1.3.2.3 GBviroFast病毒濃縮試劑盒：取3.3 mL GBviro Precipitation Buffer與配置好的10 mL糞便上清混合(體積比1∶3)，上下顛倒混勻，4 ℃過夜，12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，沉淀懸浮于500 μL生理鹽水中。

1.3.3病毒RNA的提取:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒的說明書進行操作。分為四組，取TRV病毒懸液、PEG沉淀結合超聲分離法濃縮的糞便上清、鐵離子絮凝法濃縮的糞便上清以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒濃縮的糞便上清各140 μL進行病毒RNA的提取，每組提取三份病毒RNA。

1.3.4TaqMan 熒光定量RT-PCR方法檢測病毒載量:采用前期本實驗室建立的方法[9]，對TRV病毒懸液和稀釋濃縮后的樣品進行病毒載量的檢測。

2 結果

2.1 TRV RNA標準品的標準曲線

將標準品梯度稀釋，采用已建立的熒光定量RT-PCR的檢測方法，利用5.13×106、5.13×105、5.13×104、5.13×103、5.13×102等濃度梯度，經過3次重復標準曲線相關系數R2均接近0.999，重復性良好(圖1、圖2)。

圖1 TaqMan熒光定量RT-PCR標準曲線

圖2 TaqMan熒光定量RT-PCR擴增曲線

2.2 TRV樣本和稀釋后濃縮樣本的病毒載量

對TRV病毒懸液、糞便上清稀釋后經PEG沉淀結合超聲分離法濃縮的樣品、鐵離子絮凝法濃縮的樣品以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒濃縮的樣品，即各組的三份病毒RNA為模板進行實時熒光定量PCR，通過標準曲線(圖3)，根據Ct值計算出樣品的初始模板量(表1)。

圖3 TaqMan熒光定量RT-PCR標準曲線

2.3 TRV病毒濃縮率的計算

根據TRV病毒懸液和糞便上清稀釋后經濃縮方法的濃縮效率(表2)。經濃縮方法得到的樣本量為500 μL，而提取RNA采用的體積量為140 μL，即濃縮得到的TRV病毒量=定量PCR測得的TRV病毒量×500÷140。

表1 三種濃縮方法的病毒拷貝數

表2 三種方法的濃縮效率

3 結論

糞便中病毒濃縮效果決定了病毒檢測結果的準確性，因此，采用高效穩定的濃縮方法直接影響到病毒的檢測結果。目前常用的病毒濃縮方法有超速離心、超濾濃縮、密度梯度離心、吸附洗脫等[10-14]，各方法濃縮病毒的原理和所用材料不同，故而使濃縮效果存在明顯的差異。本文采取的PEG沉淀結合超聲分離法、鐵離子絮凝法以及GBviroFast病毒濃縮試劑盒三種方法的濃縮糞便上清中的病毒，不需要受限于樣本的雜質含量。本實驗中對指示病毒TRV經糞便上清稀釋后濃縮的樣本與TRV病毒懸液的病毒載量進行比較，通過熒光定量RT-PCR直接檢測，計算各濃縮方法的回收率。

目前有鋁離子絮凝、鈣離子絮凝以及鐵離子絮凝等方法用于水體中病毒的濃縮[6，15-16]。鐵離子絮凝法是新型的病毒濃縮方法，鐵離子形成的膠體能吸附和包裹水體中的病毒并形成絮凝，可通過濾膜截留或者直接離心沉淀，其優點是操作簡單、效果穩定、快速。Hurwitz等[17]結果顯示，三氯化鐵濃縮得到的病毒/細菌的平均比約為2.2，優于切向流過濾TFF濃縮。該法一般用于海洋、飲用水等水體中病毒的濃縮，此次用于樹鼩糞便上清，效果較佳，其病毒回收效率達49.57%。相比John等[6]濃縮富集海洋病毒采取的鐵離子絮凝法中通過濾膜截留絮凝，本文直接離心沉淀的操作更簡單方便。GBviroFast病毒濃縮試劑盒用于糞便上清的病毒回收效率為26.12%，可能由于糞便上清雜質較多，回收效率并不理想。PEG沉淀病毒[18-19]是經典的病毒沉淀方法，Colombet等[20]采用PEG濃縮純化浮游生物病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀濃縮腸道組織病毒，進行超聲分離，獲得病毒上清，經超高速離心而達到二次濃縮。由于糞便上清并不是組織細胞，超聲破碎不能獲得細胞內病毒，并且此次實驗未進行二次濃縮，病毒濃縮效率僅為6.13%。從上述三種濃縮方法的病毒回收效率可以看出，濃縮方法還有待優化，可以嘗試將兩種方法或多種方法結合，相互補充，以達到更高的病毒濃縮效率，如何實現樣本濃縮的高效穩定，需要進一步摸索探討。